地奧司明激活JAK2-STAT3信號(hào)通路減輕小鼠腦缺血再灌注損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:缺血性腦血管病因高發(fā)病率、高致殘率和高病死率嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。缺血后繼發(fā)性損傷是缺血性腦血管病病情加重的主要原因，其機(jī)制主要包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能異常等，其中細(xì)胞凋亡是患者病情進(jìn)展加重及影響預(yù)后的重要因素，尋求有效的手段抑制凋亡，改善神經(jīng)功能缺損，是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。盡管細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制并不十分清晰，但最近的實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察顯示:抗凋亡蛋白Bcl-2與凋亡前蛋白Bax的平衡在調(diào)節(jié)凋亡中具有關(guān)鍵

2、作用。大量研究表明Janus activated kinase-2(JAK2)/signaltransducer and activator of transcription-3(STAT3)信號(hào)通路的激活能夠降低Bax/Bcl-2的比值，減少腦梗死后凋亡細(xì)胞數(shù)量，減小腦梗死體積，發(fā)揮腦保護(hù)作用。近年來(lái)，關(guān)于致病機(jī)制的研究取得了很大進(jìn)展，但有效治療藥物仍不足。地奧司明(Diosmin)是一種微?；兓狞S酮類化合物，研究發(fā)現(xiàn)地奧司明在慢

3、性靜脈功能不全、肝缺血再灌注損傷、糖尿病、癌癥等疾病中具有抗凋亡、抗炎等作用，而地奧司明在腦缺血中的作用及機(jī)制罕見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在小鼠短暫性大腦中動(dòng)脈阻塞（transientmiddle cerebral artery occlusion，tMCAO）所致腦缺血再灌注模型上，觀察局部腦缺血損傷后大腦皮層JAK2，phosphorylated JAK2(pJAK2)，STAT3及phosphorylated STAT3(pSTAT3)的動(dòng)態(tài)

4、表達(dá)，并研究地奧司明在腦缺血/再灌注急性期的保護(hù)作用及其對(duì)JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2及Bax的影響。
　　方法:采用成年健康雄性CD-1小鼠，應(yīng)用改良Longa線栓法建立小鼠右側(cè)tMCAO模型。實(shí)驗(yàn)一:動(dòng)態(tài)觀察腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、缺血再灌注后3h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)組。實(shí)驗(yàn)二:測(cè)定腦缺血

5、再灌注后地奧司明的神經(jīng)保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、tMCAO組、Vehicle組(tMCAO+10％乳糖)、地奧司明小劑量組（Vehicle+Diosmin50 mg/kg，DM-L）、地奧司明大劑量組(Vehicle+Diosmin100 mg/kg，DM-H)。溶劑對(duì)照組和藥物干預(yù)組動(dòng)物分別預(yù)給藥（灌胃）6天，每天一次，于末次給藥后1小時(shí)行短暫性右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞術(shù)。tMCAO組和Sham組同樣方法灌胃但給予等容

6、量生理鹽水。術(shù)后24 h對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分完畢后將動(dòng)物斷頭處死，用干濕重法測(cè)定腦組織含水量，用2％的2，3，5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法測(cè)定腦梗死體積，用尼氏染色法觀察腦組織中的尼氏小體，用免疫組化、western blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax的表達(dá)，采用激光共聚焦技

7、術(shù)觀察pSTAT3的表達(dá)部位。
　　結(jié)果:
　　1.JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的動(dòng)態(tài)觀察:JAK2、STAT3在各組間的表達(dá)無(wú)明顯差異，pJAK2、pSTAT3的表達(dá)在腦缺血/再灌注3h后開(kāi)始升高，并于24 h達(dá)高峰，72 h后開(kāi)始降低。
　　2.地奧司明對(duì)JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響:JAK2、STAT3在各組間表達(dá)無(wú)明顯變化。pJAK2、pSTAT

8、3在tMCAO組和Vehicle組表達(dá)較Sham組增加，地奧司明干預(yù)后表達(dá)量進(jìn)一步增多，地奧司明大劑量組pJAK2、pSTAT3蛋白表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，與Vehicle組相比結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);腦梗死后Bcl-2蛋白和基因表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低，而B(niǎo)ax表達(dá)則明顯增加，地奧司明大劑量組Bcl-2蛋白和基因表達(dá)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較Vehicle組增多，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Bax表達(dá)則較Vehicle組減少(P＜0

9、.05);地奧司明小劑量組可上調(diào)pJAK2、pSTAT3及Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，但趨勢(shì)不穩(wěn)定。
　　3.激光共聚焦:pSTAT3在Sham組少見(jiàn)表達(dá)，而且主要表達(dá)在神經(jīng)元胞漿，Vehicle組和DM-H組可見(jiàn)pSTAT3表達(dá)增多，以后者明顯，而且主要在細(xì)胞核表達(dá)。
　　4.神經(jīng)功能評(píng)分:Sham組無(wú)明顯神經(jīng)功能缺損，而tMCAO組、Vehicle組、地奧司明小劑量組和地奧司明大劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏

10、癱。Vehicle組與tMCAO組神經(jīng)功能評(píng)分無(wú)明顯差異，地奧司明大劑量組的神經(jīng)功能評(píng)分明顯低于Vehicle組(P＜0.05)，地奧...司明小劑量組與Vehicle組相比，神經(jīng)功能評(píng)分雖有所改善，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.腦組織含水量測(cè)定:腦缺血/再灌注后Vehicle組和tMCAO組腦組織含水量均明顯高于Sham組(Sham vs.Vehicle and tMCAO:78.24％±1.71％ vs.84.01％±1.12

11、％ and84.16％±0.75％，P＜0.01)，地奧司明大劑量組病變側(cè)腦組織含水量明顯低于Vehicle組(DM-H vs.Vehicle:81.78％±1.12％ vs.84.01％±1.12％，P＜0.01)，地奧司明小劑量組病變側(cè)腦組織含水量低于Vehicle組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6.腦梗死體積（％HLV）的測(cè)定:Sham組無(wú)梗死灶。Vehicle組和tMCAO組可見(jiàn)明顯梗死灶，而且兩組間腦梗死體積無(wú)明顯差異。與

12、Vehicle組相比，地奧司明干預(yù)組梗死體積均明顯減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Vehicle vs.DM-L and DM-H:62.06％±4.86％ vs.40.42％±6.60％ and21.44％±3.77％，P＜0.01）。
　　7.尼氏染色:與Sham組相比，tMCAO組和Vehicle組尼氏小體數(shù)量明顯下降。地奧司明干預(yù)能明顯增加尼氏小體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，與Vehicle組相比結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，DM-H組變化更