右美托咪定通過抑制JNK通路減輕大鼠腦缺血再灌注損傷.pdf

1、背景及目的：
　　缺血性腦血管病致死率、致殘率高，嚴(yán)重威脅人類健康，而且缺血區(qū)重新恢復(fù)血液灌注后，常發(fā)生缺血再灌注損傷。缺血再灌注損傷涉及一系列的復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，包括氨基酸興奮性毒性、自由基損傷、Ca2+超載、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、線粒體功能障礙等，而細(xì)胞凋亡在其中起著重要的作用。作為MAPK家族的三大成員之一，JNK能夠被一系列細(xì)胞外刺激激活，通過線粒體途徑和死亡受體途徑誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)激活caspase-3，促進(jìn)

2、細(xì)胞凋亡，加快缺血區(qū)腦細(xì)胞的死亡速度。
　　右美托咪定是高選擇性α2腎上腺素能受體激動劑，其受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周神經(jīng)系統(tǒng)和自主神經(jīng)節(jié)中廣泛分布，大量基礎(chǔ)研究表明右美托咪定有抗炎抗凋亡的特性，但機(jī)制并未完全清楚。
　　本研究試圖建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過給予右美托咪定（Dex）、α2腎上腺素受體拮抗劑育亨賓（Yoh）、JNK通路抑制劑SP600125，探討右美托咪定在腦缺血再灌注損傷中的作用是否與JNK有關(guān)，為臨床

3、更好的恢復(fù)腦缺血后大腦功能提供更為確切的理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　SD大鼠隨機(jī)分為八組（n=24），Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組、I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組。I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組采用改良線栓法建立大鼠大腦中動脈栓塞模型（MCAO），Sham組、S

4、ham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組僅分離血管，不進(jìn)行血管結(jié)扎及線栓置入，其余手術(shù)操作同缺血組。Sham+Yoh+Dex組和I/R+Yoh+Dex組在分離血管或缺血前30min腹腔注射0.5mg/kg育亨賓，分離血管或缺血即刻尾靜脈泵注右美托咪定3ug/kg，5min內(nèi)泵完，后6ug·kg-1·h-1持續(xù)泵注2h。Sham+Dex組和I/R+Dex組在分離血管或缺血前30min給予等量生理鹽水，分離

5、血管或缺血即刻給予右美托咪定。Sham組和I/R組則均給予等量生理鹽水。Sham+SP600125組和I/R+SP600125組則是分離血管或造模前30min側(cè)腦室注射10ulSP600125（溶于1％DMSO中，濃度30mg/ml）。建立大鼠暫時(shí)性局灶性腦缺血再灌注模型，缺血90min后拔出線栓，再灌注24h后進(jìn)行神經(jīng)功能評分；隨后處死大鼠，采用干濕比法檢測腦組織含水量，TTC染色測定腦組織梗死面積，免疫熒光觀察腦組織p-JNK、活化

6、的caspase-3表達(dá)變化，Western-blot分析JNK、p-JNK蛋白含量，闡明右美托咪定在大鼠腦缺血再灌注損傷中產(chǎn)生保護(hù)作用的可能機(jī)制。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：
　　收集數(shù)據(jù)并采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(-X)±S）表示，多組間定量資料比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用最小顯著差異（leastsignificantdifference,LSD）t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.

7、05。
　　結(jié)果：
　　1、神經(jīng)功能評分的比較
　　Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組大鼠從清醒至取腦組織前均無神經(jīng)功能缺損癥狀，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Sham組比較，I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組大鼠均有不同程度的左前肢肢體偏癱癥狀，神經(jīng)功能評分均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比

8、，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組神經(jīng)功能評分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex組神經(jīng)評分較I/R+Dex組明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2、腦組織含水量變化
　　Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Sham組相比，I/R組、I/R+Dex組、I/R

9、+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組腦組織含水量均明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組腦組織含水量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex組與I/R+Dex組相比，腦組織含水量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3、腦梗死面積的比較
　　Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yo

10、h+Dex組、Sham+SP600125組未發(fā)現(xiàn)梗死灶，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Sham組相比，I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組腦組織梗死面積明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組腦組織梗死面積明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；I/R+Yoh+Dex組與I/R+Dex組相比，腦組織

11、梗死面積增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4、免疫熒光觀察JNK和caspase-3激活
　　1.p-JNK的表達(dá)Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組可見少量p-JNK陽性細(xì)胞，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與Sham組相比，I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組大鼠腦組織出現(xiàn)大量p-JNK陽性細(xì)胞，p-JNK表達(dá)顯

12、著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組p-JNK表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R+Dex組相比，I/R+Yoh+Dex組p-JNK表達(dá)增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。免疫熒光雙標(biāo)顯示，p-JNK與GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞存在共表達(dá)現(xiàn)象。
　　2.cleavedcaspase-3的表達(dá)Sham組、Sham+Dex組

13、、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組可見少量cleavedcaspase-3陽性細(xì)胞，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與Sham組相比，I/R組、I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組大鼠腦組織出現(xiàn)大量cleavedcaspase-3陽性細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組cleavedcas

14、pase-3的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R+Dex組相比，I/R+Yoh+Dex組cleavedcaspase-3陽性細(xì)胞增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5、免疫印跡檢測腦組織JNK及p-JNK蛋白含量
　　Sham組、Sham+Dex組、Sham+Yoh+Dex組、Sham+SP600125組p-JNK蛋白含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與Sham組相比，IR組、I/R+Dex組、I

15、/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組p-JNK蛋白含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R組相比，I/R+Dex組、I/R+Yoh+Dex組、I/R+SP600125組p-JNK蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與I/R+Dex組相比，I/R+Yoh+Dex組p-JNK蛋白含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．JNK信號通路參與了腦缺血再灌注損傷，阻斷J