熒光定量PCR檢測哈維氏弧菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)過程中的基因表達.pdf

1、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)是廣泛存在于海洋環(huán)境中的一種發(fā)光性革蘭氏陰性菌,也是引起海洋動物弧菌病的重要條件性病原菌,能夠感染多種海洋脊椎動物和無脊椎動物?；畹姆强膳囵B(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable state,VBNC)指細菌處于不良環(huán)境時細胞縮成球形,用常規(guī)方法培養(yǎng)時不能生長繁殖,但仍然具有代謝活性及致病力的一種特殊存在形式。在適當條件下VBNC狀態(tài)的細菌能夠恢復(fù)為可培養(yǎng)狀態(tài)。已有研究發(fā)現(xiàn),哈維

2、氏弧菌在低溫寡營養(yǎng)條件下能夠進入VBNC狀態(tài)。本論文建立了檢測哈維氏弧菌基因表達的熒光定量PCR方法,研究了熱激和冷激條件下。Vhh、hsp、cysS、oppA、MnSOD和rpoS基因的表達,并進一步研究哈維氏弧菌從誘導(dǎo)進入VBNC狀態(tài)到完成復(fù)蘇的整個過程中,這幾種基因表達的動態(tài)變化。
　　 哈維氏弧菌SF-1置于40℃水浴中進行熱激處理,處理時間分別為0min、10min、20min、30min、50min。對各處理樣品進行

3、熒光定量PCR的結(jié)果顯示,hsp基因在熱激處理時表達量明顯增加,熱激處理前期表達量的增加尤其顯著。MnSOD基因在熱激10min時表達量升高為原來的9.641倍,隨后逐漸下降,到50min時其表達量大致恢復(fù)到正常水平。oppA基因的表達量隨著熱激時間的延長有明顯下降趨勢。Vhh、cysS和rpoS基因的表達量在熱激過程前期略有升高,隨后明顯下降。
　　 哈維氏弧菌SF-1置于4℃冰箱中進行冷激處理,處理時間分別為0h、1h、2h

4、、4h、8h、12h。對各處理樣品進行熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),在冷激處理過程中vhh基因和cysS基因的表達量呈下降趨勢。oppA基因表達量沒有明顯的規(guī)律性。MnSOD、rpoS和hsp基因的表達在整個冷激過程中明顯增加。
　　 哈維氏弧菌SF-1接種在人工海水中進行低溫(4℃)培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)它在低溫寡營養(yǎng)條件下誘導(dǎo)84d時進入VBNC狀態(tài)。應(yīng)用熒光定量PCR的方法,對哈維氏弧菌VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)及復(fù)蘇全過程中6個毒力相關(guān)和應(yīng)激相

5、關(guān)基因的表達水平進行動態(tài)檢測。發(fā)現(xiàn)在低溫誘導(dǎo)前期rpoS、cysS和vhh基因表達量均比正常狀態(tài)增加,隨著低溫誘導(dǎo)時間的延長,3種基因的表達量逐漸減少,進入VBNC狀態(tài)后rpoS、cysS和vhh基因的表達量分別下降為原來的0.037倍、0.055倍和0.232倍,復(fù)蘇后rpoS基因表達量約為正常狀態(tài)時的0.674.倍,而cysS基因和vhh基因表達量則均恢復(fù)到正常水平。Hsp、oppA和MnSOD基因表達量在低溫誘導(dǎo)過程及進入VBNC