CCKAR下游效應(yīng)器的融合蛋白的偏向性信號通路研究.pdf

1、胰島β細(xì)胞作為唯一一類能夠分泌胰島素的分泌細(xì)胞，在機(jī)體的血糖調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用，而胰島β細(xì)胞的生理活性會受到多種激素的共同調(diào)節(jié)。在已經(jīng)發(fā)表的眾多研究中，由小腸粘膜上皮Ⅰ細(xì)胞分泌的膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)能夠通過與胰島β細(xì)胞中表達(dá)的膽囊收縮素A受體(Cholecystokinin A receptor，CCKAR)結(jié)合來對胰島功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　CCKAR作為G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，與內(nèi)源性激動劑

2、CCK的剪切變體CCK-8s結(jié)合后，會同時激活由Gs，Gq以及β-arrestin-1介導(dǎo)的多條下游信號通路，并調(diào)控不同的生理功能。在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，已經(jīng)證明了CCKAR受體與CCK-8s相互結(jié)合，能夠通過激活下游的Gs和Gq信號通路。在胰島β細(xì)胞中，細(xì)胞表面的CCKAR激活后，能夠通過Gs信號通路調(diào)控胰島β細(xì)胞的胰島素分泌并改變機(jī)體的葡萄糖敏感性，也可以通過Gq信號通路直接影響并促進(jìn)胰島素的分泌。CCKAR與CCK-8s結(jié)合后，

3、還能夠激活β-arrestin-1信號通路，并促進(jìn)Bad蛋白的磷酸化來弱化細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。這些研究結(jié)果表明CCKAR下游不同信號通路可調(diào)控胰島β細(xì)胞不同的功能.但CCKAR偏向性途徑具體的作用機(jī)制和CCKAR偏向性信號的生理意義尚不明確。
　　基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們通過設(shè)計并構(gòu)建CCKAR與G蛋白或arrestin的人工融合蛋白(CCKAR-Gs，CCKAR-Gq和CCKAR-β-arrestin-1)，運(yùn)用G蛋白偶聯(lián)受體經(jīng)典的下

4、游信號檢測手段對于不同融合蛋白的藥理學(xué)特性進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步檢測不同信號偏向性的信號途徑對于細(xì)胞凋亡的相關(guān)作用，研究CCKAR下游不同信號通路所調(diào)控的生理功能，以其為基于CCKAR配體的糖尿病治療藥物的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，并為其他GPCR的偏向性信號通路的研究提供新的思路。
　　研究目的
　　運(yùn)用融合蛋白的技術(shù)手段構(gòu)建CCKAR-Gs，CCKAR-Gq和CCCKAR-β- aresstin-1融合蛋白，并檢測其相應(yīng)的細(xì)胞生物學(xué)

5、活性。
　　研究方法
　　1.融合蛋白的構(gòu)建準(zhǔn)備:
　　(1)SLIC-PCR的手段進(jìn)行融合蛋白的構(gòu)建;
　　(2)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測融合蛋白的表達(dá)情況;
　　2.藥理學(xué)性質(zhì)檢測:
　　(1)使用cAMP-GIoSensor的手段檢測細(xì)胞中cAMP含量在CCK-8s刺激后的變化;
　　(2)使用Fura-2鈣成像的手段檢測細(xì)胞中Ca離子在CCK-8s刺激后的變化;
　　(3)使用免疫印跡的手

6、段檢測細(xì)胞中ppERK和pBad在CCK-8s刺激后的變化;
　　3.HEK293細(xì)胞系上表達(dá)不同融合蛋白(CCKAR-Gs，CCKAR-Gq，CCCKAR-β-aresstin-1)后細(xì)胞凋亡情況的檢測
　　研究結(jié)果
　　人工構(gòu)建的CKKAR融合蛋白比較野生型的CCKAR蛋白，能夠在很大的程度上提高下游信號的偏向型，能夠直接影響并作用于單一的信號通路上，并且CCKAR-β-arrestin-1融合蛋白的過表達(dá)能夠顯著