熱壓法制備濃縮生長因子屏障膜.pdf

1、目的:
　　濃縮生長因子是2006年由Sacco發(fā)明用于促進軟硬組織修復的富有多種特性的新一代血漿提取物，主要為組織工程提供生長因子。但是膜狀的CGF不能在誘導骨組織再生手術中充當合格的屏障膜，因為CGF在體內(nèi)兩周內(nèi)降解。因此并不能為GBR提供足夠的時間和空間。本研究通過熱壓技術提高了膜狀CGF的抗溶解性，并通過動物實驗證明其能否充當合格的屏障膜，為下一步相應的臨床治療提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　第一部分制備熱壓C

2、GF:將離心完成的CGF取出后用干紗布壓干放入經(jīng)過紫外消毒的偏二乙烯薄膜（微波爐保鮮膜）后放于兩個已經(jīng)調(diào)好設定溫度的熱熨斗，加熱加壓一段時間，制成熱壓CGF。
　　第二部分體外降解實驗:由6個男性成年志愿者在同一天每人采集5個CGF樣本。樣本根據(jù)加熱溫度和時間分為對照組（未處理CGF）實驗組組A1(90℃加熱2秒)組B1(90℃加熱5秒)組C1(90℃加熱10秒)組D1(120℃加熱2秒)。將樣本放于經(jīng)過消毒的人工唾液當中并置于3

3、7℃水浴中，記錄最后降解所需天數(shù)。所有數(shù)據(jù)結果錄入spss22.0進行分析，使用單因素方差分析方法并進一步采用Tukey HSD檢驗行組間兩兩比，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。體內(nèi)降解試驗將12只大白兔分為4組。全麻后在腹部植入CGF膜和熱壓CGF.分別在第1，2，3，4周處死。將CGF膜連同鄰近的結締組織一同取材后，進行HE以及Masson染色。
　　第三部分生物活性實驗:6名男志愿者同一日采集5個樣本。將對照組和實驗組組A2(9

4、0℃加熱2秒)組B2(90℃加熱5秒)組C2(90℃加熱10秒)組D2(120℃加熱2秒）放入離心管后加入5mlα-MEM培養(yǎng)液中置于37℃恒溫箱中使生長因子釋放。在1，7，14，21天抽取其5ml培養(yǎng)液，并更換新5ml培養(yǎng)液。采集的培養(yǎng)液置于-80℃中保存。最后使用ELISA測量PDGF-AB以及TGF-beta的含量。數(shù)據(jù)進行單因素方差分析并進一步采用Tukey HSD檢驗行組間兩兩比較，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　第四

5、部分GBR手術:8只新西蘭大白兔從頸靜脈采血離心后熱壓獲得CGF屏障膜。全麻后，消毒術區(qū)，剪毛后沿頭皮矢狀切開4cm，分離表皮肌肉骨膜。使用6mm直徑環(huán)鋸鉆在左右兩側對稱制備6mm骨缺損。制備完成后放置β-TCP植骨材料行常規(guī)GBR。熱壓組使用熱壓屏障膜，膠原膜組使用Lyoplant(R)作為屏障膜，對照組只放β-TCP，空白組不做任何處理。術后每天給予抗感染治療。在術后第6周，動物安樂死。用牙科高速手機分離顱骨，并將采集后的標本放于4

6、％多聚甲醛固定，并進行Micro-CT及組織形態(tài)分析。所有數(shù)據(jù)結果錄入spss22.0進行分析，使用單因素方差分析方法并進一步采用Tukey HSD檢驗行組間兩兩比，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　結果:
　　1制備熱壓CGF:
　　隨著加熱溫度升高，在時間一定的情況下CGF膜由淡黃變白;在加熱溫度一定的條件下，時間越長CGF膜由淡黃變白。在90℃加熱10秒和120℃加熱2秒的條件下CGF膜發(fā)生皺縮變硬。
　　

7、2降解實驗:
　　體外降解實驗:對照組和實驗組A1，組B1，組C1，組D1標本所需降解時間有差異。
　　體內(nèi)降解實驗:CGF膜在體內(nèi)2周內(nèi)完全降解，熱壓CGF膜可以保持相對完整的形態(tài)達3周以上且熱壓處理后生物相容性并沒有喪失。
　　3 ELISA實驗:
　　對照組在每個時間點上都與實驗組均有顯著性差異。不論實驗組還是對照組都在在第一天釋放了大量的生長因子。熱壓處理90℃處理2s組累計釋放了相當于正常CGF52.2

8、％的PDGF-AB以及62.3％的TGF-β。90℃處理5s組累計釋放了相當于正常CGF45.0％的PDGF-AB以及47.6％的TGF-β。90℃處理10s組累計釋放了相當于正常CGF13.9％的PDGF-AB以及21.3％的TGF-β。120℃處理2s組累計釋放了相當于正常CGF10.6％的PDGF-AB以及21.4％的TGF-β。
　　4 GBR術后成骨情況:
　　空白組:缺損區(qū)主要由纖維結締組織構成，缺損周圍可見少量

9、新骨生成但未見明顯成骨反應。
　　對照組:缺損區(qū)成骨活躍，可見缺損周圍及遠離缺損處均有成骨，但在缺損處可見大量結締組織侵入
　　膠原膜組:與空白組相比纖維結締組織侵入較少，在手術邊界的植骨材料周圍可見新骨形成。在遠離手術邊界處可觀察到鈣化骨形成。在植骨材料空泡中可以觀察到破骨細胞包繞植骨材料，植骨材料周圍形成薄的編織骨，可見形成血管。
　　熱壓組:與空白組相比纖維結締組織侵入較少，可在手術邊界和遠離手術邊界處觀察到鈣化