力生長因子的制備與功能研究.pdf

1、力生長因子(Mechano growth factor，MGF)是一種新發(fā)現(xiàn)的生長因子，由Igf-1基因剪接變異產(chǎn)生。該生長因子在拉伸刺激的骨骼肌或損傷的肌肉、神經(jīng)等組織中表達(dá)被提高。進(jìn)一步的研究表明：MGF及其E肽(MGF-Ct24E)具有促進(jìn)肌肉肥大、修復(fù)損傷的功能，因而對相關(guān)疾病可能具有治療作用。但迄今為止，該蛋白還沒有進(jìn)行理化性質(zhì)和生物學(xué)功能的直接研究，原因在于尚未獲得MGF蛋白樣品。我們實驗室在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，MGF mRN

2、A在拉伸刺激的成骨細(xì)胞中高表達(dá)，提示該因子也可能是骨組織中的力響應(yīng)分子，并對成骨細(xì)胞的功能產(chǎn)生影響。這方面的研究目前還未見其他研究人員的報道。所以本課題首先開展 MGF以及MGF-Ct24E的制備，并進(jìn)一步研究它們對成骨細(xì)胞功能的影響。
　　研究目的：構(gòu)建適合中試化生產(chǎn)的MGF和MGF-Ct24E大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，建立一套有效的蛋白純化工藝，制備滿足實驗需要的蛋白樣品。制備MGF特異性多克隆抗體，用于分析拉伸刺激后成骨細(xì)胞內(nèi)MGF

3、蛋白質(zhì)的表達(dá)。構(gòu)建攜帶Mgf和Igf-1基因的重組腺病毒。通過生長因子直接作用和基因轉(zhuǎn)染，研究MGF及其E肽對成骨細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響，并分析其相關(guān)機(jī)制。
　　研究方法：以MGF DNA為模版，PCR擴(kuò)增攜帶限制性內(nèi)切酶位點和標(biāo)簽序列的截短型 MGF(des(1-3)MGF)和MGF-Ct24E的重組序列，分別插入質(zhì)粒pMAL-c2x并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21，發(fā)酵表達(dá)融合蛋白 MBP/des(1-3)MGF和MBP/MGF-

4、Ct24E，通過離子交換層析和金屬親和層析等技術(shù)純化融合蛋白，經(jīng)腸激酶酶切，rpHPLC去除MBP后，獲純凈的des(1-3)MGF和MGF-Ct24E樣品。質(zhì)譜測定樣品分子量，等電聚焦測定等電點進(jìn)行鑒定。MGF-Ct24E作抗原免疫動物，制備MGF特異性抗體，并利用抗體進(jìn)行western blot分析拉伸刺激下MGF在成骨細(xì)胞中的表達(dá)變化，免疫熒光細(xì)胞技術(shù)分析MGF在細(xì)胞內(nèi)的分布特點。構(gòu)建攜帶Mgf和Igf-1基因的腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，感

5、染成骨細(xì)胞株MC3T3-E1。通過多肽直接作用和基因轉(zhuǎn)染研究MGF、MGF-Ct24E以及IGF-1對成骨細(xì)胞增殖、遷移、分化的影響，結(jié)合抑制劑 PD98059、LY294002的使用，分析信號通路 MAPK-Erk1/2和PI3K-Akt與MGF功能的關(guān)聯(lián)。細(xì)胞增殖通過MTT法檢測，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期；Millicell-PCF細(xì)胞培養(yǎng)小室分析多肽作用下細(xì)胞的遷移；堿性磷酸酶活性、胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)、鈣沉積分析評價細(xì)胞分化。

6、　　研究結(jié)果：
　　1、將des(1-3)MGF、MGF-Ct24E的重組序列克隆入PMAL-c2x質(zhì)粒，構(gòu)成重組質(zhì)粒pMGF和pMGF24E，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21，在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)融合蛋白MBP/des(1-3) MGF和MBP/MGF-Ct24E。
　　2、補(bǔ)料分批發(fā)酵制備重組蛋白，工藝優(yōu)化后確定采用M9-YE培養(yǎng)基，含天然有機(jī)氮源的補(bǔ)料液，37℃，30％溶氧發(fā)酵，0.2mM IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。MBP/de

7、s(1-3)MGF包含體占細(xì)菌總蛋白30%，MBP/MGF-Ct24E可溶蛋白占細(xì)菌總蛋白的35%。柱層析法可以獲得純度95%以上的融合蛋白，包含體復(fù)性率80%以上。融合蛋白經(jīng)EK酶切，rpHPLC分離獲得純度達(dá)98%以上的目的蛋白des(1-3)MGF和MGF-Ct24E，質(zhì)譜鑒定二者的分子量與理論值相符。
　　3、MGF-Ct24E免疫4次獲得含特異性抗體的兔血清，經(jīng)純化后的抗體，western blot鑒定具有抗MGF特異性

8、。Western blot分析顯示拉伸刺激成骨細(xì)胞6、12、24h，MGF的表達(dá)量分別是對照組的2.7、5.2、1.1倍。免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)MGF具有核分布特性。
　　4、構(gòu)建了攜帶Mgf和Igf-1基因的重組腺病毒，成功感染成骨細(xì)胞MC3T3-E1，實現(xiàn)兩種生長因子的高水平表達(dá)。
　　5、MGF(des(1-3)MGF)、MGF-Ct24E、IGF-1三種多肽作用成骨細(xì)胞MC3T3-E1。分析細(xì)胞增殖和遷移發(fā)現(xiàn)，MGF-Ct

9、24E和MGF具有比IGF-1更顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。三種生長因子都對成骨細(xì)胞有趨化作用，其中MGF最強(qiáng)，而 MGF-Ct24E最弱。MGF-Ct24E和MGF的促增殖作用與其顯著激活MAPK-Erk1/2途徑有關(guān)，促遷移能力部分的與MAPK-Erk1/2和PI3K-Akt活化有關(guān)，其中PI3K-Akt處于主要地位。
　　6、細(xì)胞分化檢測發(fā)現(xiàn)，MGF-Ct24E和MGF具有延遲成骨細(xì)胞分化的作用。1nM的多肽處理，MGF-Ct

10、24E和MGF在細(xì)胞分化早期降低了ALP活性，而IGF-1表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在分化晚期 MGF-Ct24E對細(xì)胞的礦化也表現(xiàn)出抑制作用，而MGF沒有這種效應(yīng)。另外MGF-Ct24E和MGF抑制了Col1的表達(dá)，但提高了OPN的表達(dá)。MGF-Ct24E和MGF對成骨細(xì)胞分化的延遲效應(yīng)與Erk1/2的激活有關(guān)，抑制Erk1/2活化，ALP的表達(dá)被逆轉(zhuǎn)，而MGF和IGF-1激活A(yù)kt促進(jìn)了細(xì)胞分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MGF-Ct24E和MGF對轉(zhuǎn)錄

11、因子Cbfα-1的核轉(zhuǎn)運(yùn)有抑制作用，這可能是細(xì)胞分化受到抑制的原因之一。
　　結(jié)論：本研究成功構(gòu)建了MGF和MGF-Ct24E的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，并實現(xiàn)了發(fā)酵表達(dá)，建立了一套完整的重組蛋白純化和復(fù)性工藝，證明MGF可以通過原核表達(dá)的方式獲得。獲得的MGF-Ct24E可以免疫動物獲得抗MGF特異性抗體，利用該抗體通過western blot分析，在蛋白質(zhì)水平證實拉伸刺激能夠刺激成骨細(xì)胞表達(dá) MGF。通過細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，MGF及其 E肽