力生長(zhǎng)因子的原核表達(dá)及其活性檢測(cè).pdf

1、人的力生長(zhǎng)因子(Mechano-growth factor,MGF)是一個(gè)由110個(gè)氨基酸組成的堿性多肽,在受到應(yīng)力刺激的肌肉組織中局部表達(dá)。國外研究證實(shí)該因子具有激活肌肉衛(wèi)星細(xì)胞,促使肌肉肥大的作用。這種效應(yīng)可能由于該因子激活了成肌細(xì)胞有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)該因子在受到拉伸刺激的成骨細(xì)胞中也有高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究該因子在骨組織中的功能,我們克隆了MGF全基因序列,在E.coli中進(jìn)行了該因子的表達(dá),獲得了較為理想的結(jié)果;同時(shí)研究了純化回

2、收的MGF蛋白對(duì)MC3T3-E1前成骨細(xì)胞增殖和分化的影響。主要工作及結(jié)論如下:①將MGF基因亞克隆在pMAL-c2x的BamHⅠ、EcoRⅠ多克隆位點(diǎn)之間,使MGF位于MBP基因的閱讀框之內(nèi),在Taq啟動(dòng)子的控制下實(shí)現(xiàn)MBP/MGF蛋白融合表達(dá);②利用重組質(zhì)粒pMAL-c2x-MGF在BL21菌中表達(dá)目的蛋白,對(duì)影響蛋白表達(dá)產(chǎn)量的三個(gè)主要因素(表達(dá)時(shí)間、溫度、IPTG濃度)進(jìn)行了選擇優(yōu)化,最終確定一個(gè)最佳的表達(dá)條件:溫度為37℃,IP

3、TG濃度為0.4mM,誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)的情況下目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)量最高;③超聲破菌發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體的形式存在,采用2M的低濃度尿素洗滌包涵體沉淀,8M的高濃度尿素溶解包涵體,以Ni-NTA樹脂分離純化目的蛋白,然后通過透析法復(fù)性目的蛋白,最后用EK酶酶切后通過Q柱純化回收得到天然結(jié)構(gòu)的MGF蛋白;④利用濃度梯度的MGF作用于MC3T3-E1前成骨細(xì)胞,通過MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的方法研究了細(xì)胞響應(yīng)MGF蛋白作用后增殖能力的變化

4、。發(fā)現(xiàn)各濃度組都能促進(jìn)細(xì)胞的增殖,但10ng/ml和50ng/ml的MGF能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖(P＜0.01),而低于、高于或二者之間的MGF濃度均表現(xiàn)出相對(duì)弱一些的的影響;⑤利用濃度梯度的MGF作用于MC3T3-E1細(xì)胞。從細(xì)胞堿性磷酸酶活力的變化結(jié)果顯示,MGF抑制了細(xì)胞表達(dá)ALP,且這種抑制作用與MGF的濃度和作用時(shí)間相關(guān),10、25ng/ml的MGF在作用48小時(shí)后對(duì)ALP的抑制最顯著(P＜0.01);⑥進(jìn)一步用10ng/ml

5、的MGF作用細(xì)胞,利用RT-PCR分析細(xì)胞骨橋蛋白( osteopontin,OPN)、核心接合因子α1(Core-binding factorα1,cbfα-1)及Ⅰ型膠原(CollagenⅠ, ColⅠ)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。其中,OPN、cbfα-1基因,實(shí)驗(yàn)組在MGF作用24、48小時(shí)后與對(duì)照組相比在mRNA水平上有顯著性差異(P＜0.01);而ColⅠ基因,實(shí)驗(yàn)組在MGF作用24小時(shí)后與對(duì)照組在mRNA水平出現(xiàn)明顯差異(P＜0.