重組細(xì)胞生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究.pdf

1、[研究背景]人促血液血管細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HAPO)是研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)造血干細(xì)胞，內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、黏附、趨化的功能。HAPO蛋白最初是從再生障礙性貧血病人尿液中提取的天然蛋白，對(duì)其功能進(jìn)行了深入的研究后成功地構(gòu)建了原核表達(dá)體系，并測(cè)定了重組蛋白的細(xì)胞因子活性。 N端測(cè)序顯示HAPO蛋白是糖蛋白4(PRG4)的一個(gè)不同剪接體形式。HAPO蛋白N端為由PRG4第2、3外顯子編碼的兩個(gè)促細(xì)胞生成素B結(jié)構(gòu)域(SMB)

2、，中間為第4外顯子編碼的假定的肝素結(jié)合區(qū)(pHBD)，C端為第6外顯子編碼的黏液素樣重復(fù)序列。PRG4尚有若干剪接體形式，其中有兩種為第4、5外顯子同時(shí)缺失和3、4、5三個(gè)外顯子同時(shí)缺失。這為表達(dá)缺失突變蛋白以研究rhHAPO各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能提供了條件。 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)HAPO蛋白的各項(xiàng)研究課題主要集中在本實(shí)驗(yàn)室以及與香港和法國(guó)等實(shí)驗(yàn)室的合作上，工作的重點(diǎn)在于臨床實(shí)驗(yàn)探討HAPO與疾病的相關(guān)性，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討HAPO生理功能等。已

3、制備得到單克隆抗體，釣得受體，發(fā)現(xiàn)下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一為磷酸酯酶3激酶-ATP途徑等等，但是對(duì)于其結(jié)構(gòu)的研究是一個(gè)空白。僅僅局限于NCBI網(wǎng)站BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索程序給出的關(guān)于HAPO蛋白含有4個(gè)結(jié)構(gòu)域的信息。因此，rhHAPO結(jié)構(gòu)和功能相結(jié)合的研究將能夠更好的理解與HAPO蛋白相關(guān)的各種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 [實(shí)驗(yàn)內(nèi)容]本研究在分子克隆構(gòu)建原核表達(dá)體系基礎(chǔ)上，利用HPLC，MALDI-TOF-MS，CD，BLS等實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究了

4、以下四個(gè)版塊的內(nèi)容，彼此之間有交叉和銜接：?jiǎn)误w分子四個(gè)結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)功能發(fā)揮的影響；不同聚集體分子功能的比較；不同剪接體蛋白對(duì)聚集行為的影響；驗(yàn)證假定的肝素結(jié)合區(qū)(pHBD)是否結(jié)合肝素。 [實(shí)驗(yàn)?zāi)康腯闡明rhHAPO活性功能區(qū)所在；闡明形成聚集的區(qū)域所在；找到活性最高穩(wěn)定性最佳的剪接體和聚集體形式；提供初步的理化特性，為rhHAPO新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)。 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果] 1.優(yōu)化了重組蛋白表達(dá)的純化工藝，

5、得到高純度高均一性的rhHAPO蛋白。測(cè)定部分理化特性為：pI=8.52為堿性蛋白；高親水性，在溶液中以穩(wěn)定的四聚體和微量的二聚體形式存在，為非二硫鍵形成的聚集；單體分子量為32.7kD；二級(jí)結(jié)構(gòu)以loop為主。 2.四聚體和二聚體蛋白活性測(cè)定比較顯示兩者均能促進(jìn)前者促進(jìn)HESS-5細(xì)胞的黏附，四聚體促黏附的功能較后者強(qiáng)。 3.克隆表達(dá)了rhHAPOC末端缺失的突變體蛋白，純化后仍為四聚體蛋白。在此基礎(chǔ)上利用同一對(duì)引物，

6、進(jìn)一步克隆表達(dá)了pHBD缺失的重組蛋白。此二聚體蛋白為酸性蛋白，以二聚體形式存在于生理鹽水中。SMB結(jié)構(gòu)域和pHBD序列均參與了蛋白的自我聚集行為。4.四聚體rhHAPO能夠結(jié)合肝素，但是這種結(jié)合并不引起構(gòu)象上的改變。二聚體蛋白不結(jié)合肝素，表明從二聚體到四聚體存在結(jié)構(gòu)的改變而導(dǎo)致結(jié)合活性的改變。pHBD多肽也不結(jié)合肝素，說(shuō)明四聚提與肝素的結(jié)合需要多個(gè)功能位點(diǎn)。 [結(jié)論]本研究發(fā)現(xiàn)原核表達(dá)的rhHAPO蛋白具有自我聚集的特點(diǎn)，在溶