代謝應(yīng)激條件下過表達NDRG2對肝癌細胞存活的抑制作用及其機制研究.pdf

1、在腫瘤的形成和發(fā)展過程中，常常伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的供給不足。特別是在實體瘤的迅速增長過程中，由于相對血供不足，常導(dǎo)致瘤體內(nèi)的許多區(qū)域缺乏氧氣和葡萄糖等營養(yǎng)物質(zhì)。在這種情況下，腫瘤細胞必須通過代謝模式的改變以適應(yīng)惡劣的微環(huán)境。腫瘤細胞代謝重編程最為熟知的當(dāng)屬Warburg效應(yīng)，其典型特征是主要通過增強產(chǎn)能效率低下的糖酵解途徑來生產(chǎn)ATP并伴隨大量乳酸的形成。除此之外，腫瘤細胞也常常發(fā)生谷氨酰胺代謝和脂代謝的重編程，例如在缺乏葡萄糖等應(yīng)激

2、情況下，腫瘤細胞通過增強脂肪酸氧化分解來提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，維持細胞存活。由于這種對代謝應(yīng)激的適應(yīng)能力，在臨床抗血管生成藥物治療后，復(fù)發(fā)的腫瘤細胞甚至表現(xiàn)出更強的增殖和轉(zhuǎn)移能力。因此，研究腫瘤代謝重編程的分子機制具有重要的理論意義，也能為腫瘤的分子靶向治療提供新策略。
　　NDRG2是我們課題組首先報道的抑癌基因，在人體多種腫瘤組織中低表達，過表達NDRG2后可以抑制多種腫瘤細胞系的增殖、遷移和侵襲。另外，NDRG2還參與細胞的多

3、種應(yīng)激反應(yīng)。更為重要的是，越來越多的研究證實NDRG2與腫瘤細胞代謝有密切關(guān)系。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2能夠抑制乳腺癌細胞的葡萄糖攝取和結(jié)腸癌細胞的糖酵解和谷氨酰胺代謝。然而NDRG2是否參與腫瘤細胞脂代謝還未見報道。
　　基于此，本課題擬以過表達NDRG2的肝癌細胞為研究模型，探討實體瘤因微環(huán)境異質(zhì)性和基質(zhì)脫落等代謝應(yīng)激條件下NDRG2在肝癌細胞中的作用。
　　目的：
　　1.明確代謝應(yīng)激時NDRG2對肝癌細胞

4、存亡的影響;
　　2.研究缺糖應(yīng)激時NDRG2對肝癌細胞能量及氧化還原狀態(tài)的影響;
　　3.探究NDRG2在肝癌細胞缺糖應(yīng)激中所起作用的分子機制。
　　方法：
　　1.利用慢病毒感染構(gòu)建過表達NDRG2的肝癌細胞系Huh7和Sk-hep-1及表達Cherry的對照細胞，qPCR和Western blot檢測NDRG2的表達情況；CCK8實驗檢測和比較上述細胞在正常培養(yǎng)和代謝應(yīng)激情況下的細胞活力；克隆形成實驗檢測正

5、常培養(yǎng)和缺糖應(yīng)激下的克隆形成能力；流式細胞術(shù)和TUNEL染色檢測細胞凋亡。
　　2.分別用ATP檢測試劑盒、NADP/NADPH定量比色試劑盒和DCFH-DA探針檢測NDRG2過表達和對照肝癌細胞在正常培養(yǎng)和缺糖應(yīng)激情況下的細胞內(nèi)ATP水平、NADPH含量和NADP+/NADPH比值以及細胞內(nèi)ROS水平。
　　3. qPCR檢測過表達NDRG2和對照肝癌細胞在正常培養(yǎng)和缺糖應(yīng)激下脂肪酸氧化(FAO)關(guān)鍵調(diào)控分子的表達情況。給

6、予PPARα的激活劑BEZA(400μM)和CPT1A的抑制劑ETO(100μM)后，分別用ATP檢測試劑盒、NADP/NADPH定量比色試劑盒和CCK-8檢測上述細胞在低糖應(yīng)激下的細胞內(nèi)ATP水平、NADPH含量以及細胞存活情況。
　　4. Western blot檢測NDRG2過表達肝癌細胞在正常和缺糖情況下AMPK/ACC通路的活化情況（p-AMPKα, AMPKα, p-ACC和ACC）；在NDRG2過表達細胞Huh7中強

7、行表達組成性活化的AMPKα，Western blot比較AMPK信號通路的活化情況，流式細胞術(shù)比較細胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　1. CCK-8實驗、克隆形成實驗和凋亡檢測結(jié)果表明，缺糖應(yīng)激條件下過表達NDRG2抑制肝癌細胞存活，降低肝癌細胞的克隆形成能力，促進缺糖應(yīng)激中肝癌細胞的凋亡。
　　2.細胞內(nèi)ATP、NADPH和ROS檢測結(jié)果表明，過表達NDRG2降低缺糖應(yīng)激條件下肝癌細胞內(nèi)ATP和NADPH含量，升高NAD

8、P+/NADPH比值和細胞內(nèi)ROS水平，過表達NDRG2加劇了缺糖應(yīng)激下肝癌細胞能量和氧化還原失衡。
　　3. NDRG2過表達可抑制缺糖應(yīng)激誘導(dǎo)的脂肪酸氧化相關(guān)分子PPARα、CPT1A和ACADM的表達上調(diào)及脂肪酸氧化的活化。PPARα的激動劑BEZA可增加缺糖應(yīng)激時NDRG2過表達肝癌細胞內(nèi)ATP和NADPH含量，從而削弱缺糖時NDRG2對細胞存活的抑制作用。反之，CPT1A的抑制劑ETO則顯著降低細胞ATP和NADPH含量

9、，抑制缺糖應(yīng)激下的細胞存活，該作用在對照細胞中比NDRG2過表達細胞更明顯。
　　4. NDRG2過表達可抑制缺糖應(yīng)激條件下肝癌細胞中AMPK信號通路的活化；組成性活化的AMPK可逆轉(zhuǎn)NDRG2對AMPK信號通路的抑制作用并部分緩解缺糖應(yīng)激誘導(dǎo)的肝癌細胞凋亡。
　　結(jié)論：缺糖應(yīng)激條件下過表達NDRG2通過抑制肝癌細胞AMPK信號通路的活化，干擾脂肪酸氧化的激活，加劇肝癌細胞的能量耗竭和氧化應(yīng)激并導(dǎo)致細胞凋亡，最終降低缺糖應(yīng)激