慢性萎縮性胃炎模型大鼠定量蛋白組學(xué)及中藥干預(yù)靶點(diǎn)研究.pdf

1、背景及目的
　　慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis，CAG)是慢性胃炎的亞型之一。胃黏膜萎縮，腸上皮化生(intestinal metaplasia，IM)及伴發(fā)的異型增生(Dysplasia，Dys)，與胃癌發(fā)病密切相關(guān)。CAG是最常見(jiàn)的胃癌前疾病。CAG發(fā)病率及檢出率隨年齡增長(zhǎng)而增加，已經(jīng)嚴(yán)重威脅著我國(guó)人民的身體健康。目前，對(duì)于CAG的發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)制尚不明確，亦無(wú)有效藥物治療。本病因?yàn)椴∏?/p>

2、進(jìn)展緩慢、診斷及療效評(píng)價(jià)需行胃鏡及病理活檢有創(chuàng)檢查，病變常常灶性分布，而且患者多為中老年人，往往合并其他慢性病，病情復(fù)雜，使得針對(duì)本病的臨床試驗(yàn)較難開(kāi)展。復(fù)制本病動(dòng)物疾病模型以大大縮短病程，去除不必要因素對(duì)于疾病影響，尤其規(guī)避倫理問(wèn)題，可有力地推動(dòng)本病的病因?qū)W、發(fā)病學(xué)以及防治方法的研究。由于CAG病因復(fù)雜，西醫(yī)學(xué)對(duì)CAG尚缺乏理想的治療措施，而中醫(yī)藥辨證治療療效甚佳，不但能緩解癥狀，在延緩病理進(jìn)展甚至逆轉(zhuǎn)病變方面有一定優(yōu)勢(shì)。隨著對(duì)CAG

3、認(rèn)識(shí)的不斷深入和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療CAG的機(jī)制研究也得到了深入和發(fā)展。CAG動(dòng)物模型是深入研究發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)相關(guān)藥物效果的必不可少的工具。目前CAG大鼠模型造模方法眾多，缺乏客觀評(píng)價(jià)。針對(duì)以上問(wèn)題，本文展開(kāi)如下研究:對(duì)比兩種不同慢性萎縮性胃炎大鼠復(fù)合造模法，通過(guò)成模時(shí)間、模型成功率、大鼠死亡率、血清胃蛋白酶原檢測(cè)、病理組織學(xué)觀察等方面確定穩(wěn)定造模方法;利用TMT定量蛋白組學(xué)技術(shù)鑒定慢性萎縮性胃炎模型大鼠與正常大鼠胃黏膜的

4、差異蛋白，采用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析，闡釋本病發(fā)病的生物學(xué)基本分子機(jī)制，結(jié)合蛋白富集分析及節(jié)點(diǎn)蛋白連接度分析篩選靶點(diǎn)蛋白，利用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)及實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)靶點(diǎn)蛋白在CAG模型大鼠胃黏膜中異常表達(dá)，從而驗(yàn)證蛋白組學(xué)結(jié)果;選用以半夏瀉心湯加減，立法于辛開(kāi)苦降、益氣活血的中藥協(xié)定方為干預(yù)藥物，探索中藥對(duì)CAG的治療作用，初步篩選中藥作用靶點(diǎn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分為以下三部分。
　　1.慢性萎縮性胃炎動(dòng)物模型的

5、探索
　　材料與方法
　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)4周齡健康雄性SD大鼠60只。按體重隨機(jī)分為3組。正常組大鼠8只;N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-Methyl-N-nitroso-N'-nitroguanidine，MNNG)復(fù)合高鹽熱淀粉糊造模法組(M1組)26只SD大鼠;MNNG復(fù)合酒精綜合造模法（M2組）26只SD大鼠。正常組大鼠予SPF級(jí)正常水料飼養(yǎng)，每天灌胃1次5ml生理鹽水。M1組予0.03％雷尼替丁飼料喂養(yǎng)，

6、自由飲用2％水楊酸鈉溶液，每日灌胃120μg/mLMNNG次，每周禁食1次，每次18小時(shí)，自第14周起禁食第2天灌胃高鹽熱淀粉糊，當(dāng)天不再灌胃MNNG溶液。M2組大鼠予0.03％雷尼替丁飼料喂養(yǎng)，每日自由飲用2％水楊酸鈉溶液，每日灌胃120μg/mL MNNG1次，每周禁食1次，每次18小時(shí)，自第14周起禁食第2天灌胃35％酒精，當(dāng)天不再灌胃MNNG溶液，連續(xù)造模至18周，M1、M2組大鼠每2周隨機(jī)處死2只，取胃觀察胃黏膜病理改變。通過(guò)

7、成模時(shí)間、模型成功率、大鼠死亡率、血清胃蛋白酶原檢測(cè)、病理組織學(xué)觀察等方面確定穩(wěn)定造模方法。
　　結(jié)果
　　MNNG復(fù)合酒精灌胃造模方法及MNNG復(fù)合高鹽熱淀粉糊造模方法均可較好復(fù)制CAG病變過(guò)程;兩組大鼠胃黏膜病理積分、血清胃蛋白酶原水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);兩組大鼠肝細(xì)胞H&E染色病理切片觀察均發(fā)現(xiàn)空泡變性，為早期肝臟損傷表現(xiàn)，考慮與MNNG在肝臟中代謝相關(guān);MNNG復(fù)合酒精灌胃造模方法動(dòng)物死亡率較低，并發(fā)癥較少

8、，可用于后續(xù)萎縮性胃炎動(dòng)物試驗(yàn)的應(yīng)用研究。
　　2.慢性萎縮性胃炎模型大鼠定量蛋白組學(xué)研究
　　材料與方法
　　利用TMT(Tandem Mass Tags)定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選MNNG復(fù)合酒精灌胃CAG模型大鼠胃竇黏膜組織（制備方法同實(shí)驗(yàn)1）與正常大鼠胃竇黏膜組織的差異蛋白，采用高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析闡釋慢性萎縮性胃炎胃黏膜發(fā)生的生物學(xué)基本分子機(jī)制。并結(jié)合蛋白功能富集分析結(jié)果、信息通路富集結(jié)果、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析、節(jié)點(diǎn)蛋白

9、連接度分析，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白。
　　結(jié)果
　　(1)通過(guò)TMT定量蛋白組學(xué)鑒定CAG大鼠胃竇黏膜組織與正常大鼠胃竇黏膜組織的差異表達(dá)蛋白共鑒定6937個(gè)蛋白，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異蛋白363個(gè)，采用GO分析軟件David生物信息學(xué)軟件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp)分別從分子功能、亞細(xì)胞定位和生物學(xué)途徑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面對(duì)差異蛋白進(jìn)行功能注釋。分子功能富集顯示差異蛋白主要為bi

10、nding蛋白，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外的外來(lái)體、細(xì)胞外空間、線粒體、胞質(zhì)、粘著斑、細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核周?chē)牡貐^(qū)等區(qū)域，生物學(xué)途徑主要參與應(yīng)對(duì)藥物、應(yīng)對(duì)乙醇、應(yīng)對(duì)饑餓，其他在蛋白質(zhì)水解、缺氧、補(bǔ)體經(jīng)典反應(yīng)、細(xì)胞粘附等生物過(guò)程起到作用。涉及粘著斑通路、MAPK信號(hào)通路、阿米巴病、病毒致癌、緊密連接、腫瘤的蛋白聚糖、補(bǔ)體系統(tǒng)、蛋白質(zhì)消化吸收等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，經(jīng)STRING網(wǎng)軟件分析表明差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜。
　　(2)并將互作網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)

11、出到Cytoscape3.2軟件中，根據(jù)節(jié)點(diǎn)蛋白連接度分析，判斷網(wǎng)絡(luò)中心節(jié)點(diǎn)蛋白。綜合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的信號(hào)通路分類(lèi)、功能注釋等，篩選出關(guān)鍵蛋白選取FLNa、TGFR-β1、Bad蛋白，以ELISA、RT-PCR方法驗(yàn)證本次蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)3）。
　　(3)通過(guò)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)具有促凋亡作用的Casp3降低，而B(niǎo)cl-2家族促凋亡因子Bad上調(diào)。Caspase家族處于Bcl-2家族下游。Bad的促凋亡作用依賴(lài)于與Bcl

12、-2結(jié)合，蛋白組學(xué)結(jié)果并未顯示Bcl-2表達(dá)異常。為了探究Bad表達(dá)的上調(diào)對(duì)Bcl-2家族調(diào)控的凋亡的影響，采用RT-PCR方法鑒定CAG模型大鼠與正常大鼠胃竇黏膜中Bcl-2 mRNA表達(dá)（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)3）。
　　3.差異蛋白的驗(yàn)證及中藥干預(yù)慢性萎縮性胃炎大鼠作用靶點(diǎn)研究
　　材料與方法
　　100只SPF級(jí)SD大鼠根據(jù)體重隨機(jī)分為兩組。空白組（N組）10只，給以SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)，每日灌胃生理鹽水1次，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)

13、束。造模組90只，按上述方法進(jìn)行CAG造模，于實(shí)驗(yàn)第18，20，22，24，26周末各隨機(jī)抽檢2只處死，取胃黏膜觀察病理改變。造模成功后，將剩余大鼠按體重隨機(jī)分成4組，模型組（M組），模型對(duì)照組（C組），慢性萎縮性胃炎協(xié)定方高劑量組（G組）、慢性萎縮性胃炎協(xié)定方低劑量組（D組）。成模后N組、M組大鼠即刻處死。其余大鼠均給予SPF級(jí)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)飲食喂養(yǎng)。C組予生理鹽水3mL/kg灌胃，每日1次;G組、D組分別予慢性萎縮性胃炎協(xié)定方配方顆粒劑制

14、備藥液5ml，分別相當(dāng)于顆粒劑3g/kg/d、1.5g/kg/d(相當(dāng)于生草藥21.9g/kg/d、11g/kg/d)灌胃，每日1次。治療階段持續(xù)8周，治療結(jié)束后處死大鼠。觀察大鼠胃黏膜病理改變，評(píng)價(jià)中藥協(xié)定方治療CAG的療效。利用ELISA法測(cè)定N組、M組胃竇黏膜TGF-β1、FLNa、Bad蛋白表達(dá)水平，RT-PCR法測(cè)定N組、M組、G組、D組胃竇黏膜TGF-β1、FLNa、Bad、Bcl-2的mRNA水平。
　　結(jié)果

15、　　(1)中藥協(xié)定方可顯著改善CAG模型大鼠胃竇黏膜萎縮（P＜0.05）、異型增生（P＜0.05），腸上皮化生積分較模型組大鼠有所下降，但未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　(2) ELISA法測(cè)定TGF-β1、FLNa、Bad蛋白在M組、C組大鼠胃黏膜表達(dá)較N組上調(diào)(P＜0.05); RT-PCR法測(cè)定M組、C組大鼠胃黏膜TGF-β1mRNA、FLNa mRNA、Bad mRNA表達(dá)較N組上調(diào)（P＜0.05）。M組、C組大鼠與N組大鼠Bc

16、l-2的mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯差異，與蛋白組學(xué)結(jié)果一致。考慮CAG模型大鼠胃黏膜中異常上調(diào)的Bad蛋白可能無(wú)活性，未能引起下游Bcl-2家族的表達(dá)改變。
　　(3) RT-PCR測(cè)定中藥組TGF-β1、FLNa、Bad的mRNA表達(dá)量較M組、C組水平下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論
　　(1)本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)并加以改進(jìn)，對(duì)比MNNG溶液復(fù)合酒精灌胃及MNNG復(fù)合高熱淀粉糊灌胃，綜合對(duì)比成模時(shí)間、死亡率、病理轉(zhuǎn)化率、肝

17、臟病理改變等確定MNNG溶液復(fù)合酒精灌胃模型該模型操作簡(jiǎn)單易行，且穩(wěn)定性較好，但仍有耗時(shí)較長(zhǎng)的不足，有待于今后進(jìn)一步改進(jìn)。
　　(2)采用高通量蛋白組學(xué)法篩選MNNG溶液復(fù)合酒精灌胃模型大鼠與正常大鼠胃竇黏膜間差異蛋白，通過(guò)GO分析及Pathway分析可說(shuō)明，CAG胃黏膜病變涉及多項(xiàng)、復(fù)雜生物途徑，影響粘著斑、MAPK、緊密連接、蛋白聚糖改變、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)等多條通路。根據(jù)節(jié)點(diǎn)蛋白連接度分析篩選出FLNa、Bad、及TGF-β