綿羊創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直動(dòng)物模型的特點(diǎn)及其分子機(jī)制初步研究.pdf

1、顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直（TMJA）是一種影響口腔顱頜面系統(tǒng)功能和形態(tài)的致殘性疾病，臨床表現(xiàn)為張口及咀嚼困難等，發(fā)生在青少年時(shí)可致小下頜畸形，嚴(yán)重影響患兒的身心健康。迄今，臨床上關(guān)于TMJA的治療方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且療效不佳，術(shù)后易復(fù)發(fā)。多數(shù)臨床研究報(bào)道，外傷是引起TMJA最常見(jiàn)的誘因，而髁突矢狀骨折（SFMC）又是外傷中最常見(jiàn)的骨折類(lèi)型。關(guān)于創(chuàng)傷性TMJA的學(xué)說(shuō)很多，但目前無(wú)任何一種學(xué)說(shuō)能解釋創(chuàng)傷性TMJA發(fā)生的機(jī)制，同樣，對(duì)于SFMC后易發(fā)

2、生創(chuàng)傷性TMJA也沒(méi)有統(tǒng)一的解釋。通過(guò)總結(jié)自己和前人的研究成果，我們課題組曾提出翼外肌（LPM）的收縮作用是引起創(chuàng)傷性TMJA發(fā)生的重要因素。我們知道，翼外肌的解剖結(jié)構(gòu)，主要分為上下兩頭，絕大部分LPM肌纖維附著在關(guān)節(jié)翼肌窩，當(dāng)發(fā)生SFMC后進(jìn)行開(kāi)口運(yùn)動(dòng)時(shí)，翼外肌作為主要的開(kāi)口肌通過(guò)肌肉收縮作用將損傷的髁突內(nèi)側(cè)骨折塊牽拉向內(nèi)、下、前側(cè)。髁突矢狀骨折常伴有關(guān)節(jié)盤(pán)及關(guān)節(jié)窩的損傷和張口受限，進(jìn)而引起創(chuàng)傷性TMJA的發(fā)生。但我們前期研究并未發(fā)生

3、創(chuàng)傷性TMJA。綜上所述，我們提出了新假說(shuō)，在SFMC愈合過(guò)程中，由于反復(fù)的功能性開(kāi)閉口運(yùn)動(dòng)，LPM作為開(kāi)口肌反復(fù)收縮牽拉骨折塊，進(jìn)而在髁突外側(cè)殘端和內(nèi)側(cè)SFMC骨折塊之間發(fā)生類(lèi)牽張成骨（DO）作用，從而導(dǎo)致SFMC骨折塊與外側(cè)殘端間形成大量新骨，進(jìn)而使髁突形態(tài)明顯畸形及體積增大。同時(shí)，在升頜肌群的作用下使髁突外側(cè)骨折殘端通過(guò)破損的關(guān)節(jié)盤(pán)與損傷的關(guān)節(jié)窩直接接觸為T(mén)MJ外側(cè)骨橋的形成提供必要條件，加上翼外肌的牽拉作用使髁突矢狀骨折塊與外側(cè)

4、殘端之間形成大的空腔，血液充盈并機(jī)化。我們推測(cè)以上所有因素共同作用最終導(dǎo)致創(chuàng)傷性TMJA的發(fā)生。本研究共選取57只綿羊分成五個(gè)實(shí)驗(yàn)如下：
　　實(shí)驗(yàn)一、創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直動(dòng)物模型的建立
　　目的：通過(guò)模擬髁突矢狀骨折、關(guān)節(jié)盤(pán)和關(guān)節(jié)窩的損傷以及切斷翼外肌與否建立創(chuàng)傷性TMJ骨性強(qiáng)直動(dòng)物模型。
　　方法：以14只綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物(從001～014編號(hào))，隨機(jī)均等分為12周和24周處死組。所有動(dòng)物左側(cè)TMJ作為實(shí)驗(yàn)組，模擬

5、SFMC(髁突矢狀骨折)、切除1/4關(guān)節(jié)盤(pán)并制造關(guān)節(jié)窩“井”字型損傷，隨后阻斷翼外肌功能；右側(cè)TMJ作為對(duì)照組，除保留翼外肌功能外，其它手術(shù)過(guò)程與實(shí)驗(yàn)組相同。術(shù)后12周和24周分別處死7只動(dòng)物，通過(guò)大體觀察及螺旋CT方法觀察關(guān)節(jié)復(fù)合體中關(guān)節(jié)間隙、上下關(guān)節(jié)面及髁突內(nèi)外徑、前后徑等形態(tài)變化。
　　結(jié)果：與術(shù)前比較，術(shù)后12周、24周所有動(dòng)物的開(kāi)口度均不同程度降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p均為0.000）。對(duì)照組（保留翼外肌功能）在關(guān)節(jié)外側(cè)均

6、發(fā)生了TMJ骨性強(qiáng)直，關(guān)節(jié)間隙變窄可見(jiàn)不規(guī)則鈣化影像，髁突呈內(nèi)外向“Y”型分叉。與術(shù)前比較，術(shù)后12周和24周，實(shí)驗(yàn)組（阻斷翼外肌功能）關(guān)節(jié)復(fù)合體形態(tài)無(wú)明顯變化，只發(fā)生纖維粘連。而術(shù)后12周、24周，對(duì)照組髁突內(nèi)外徑及前后徑較實(shí)驗(yàn)組明顯增大畸形（p均為0.000）。
　　結(jié)論：創(chuàng)傷性TMJ骨性強(qiáng)直動(dòng)物模型成功建立，多創(chuàng)傷因素共同作用最終導(dǎo)致TMJ骨性強(qiáng)直的發(fā)生，翼外肌是創(chuàng)傷性TMJ骨強(qiáng)直發(fā)生的重要因素，翼外肌的作用使髁突骨折區(qū)形成

7、大量新骨，進(jìn)而導(dǎo)致髁突畸形增大。
　　實(shí)驗(yàn)二、顳下頜關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直CT影像學(xué)特征與最大開(kāi)口度之間的相關(guān)性研究
　　目的：測(cè)量主動(dòng)和被動(dòng)最大開(kāi)口度并分析其與顳下頜關(guān)節(jié)強(qiáng)直骨融合區(qū)三維CT影像學(xué)特征間的相關(guān)性。
　　方法：28只綿羊作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從001～028編號(hào)，隨機(jī)均等分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（實(shí)驗(yàn)組14只綿羊用于動(dòng)物模型的制備；對(duì)照組14只綿羊不做手術(shù)，只測(cè)量體重、主動(dòng)及被動(dòng)最大開(kāi)口度）。術(shù)前、術(shù)后12周、24周分別測(cè)量體

8、重、主動(dòng)和被動(dòng)最大開(kāi)口度，并進(jìn)行螺旋CT掃描。實(shí)驗(yàn)組的手術(shù)步驟同實(shí)驗(yàn)一。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析TMJ強(qiáng)直骨融合區(qū)的CT特征（包括在冠狀面、矢狀面及水平面上，分析骨性強(qiáng)直TMJ復(fù)合體骨融合區(qū)及髁突骨球的寬度、長(zhǎng)度及面積，以及骨融合區(qū)的鈣化程度）與主動(dòng)及被動(dòng)最大開(kāi)口度間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，術(shù)后12周及24周，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物均有不同程度張口受限，主動(dòng)、被動(dòng)最大開(kāi)口度和極限感覺(jué)距離均明顯變小（p均為0.000）。在實(shí)驗(yàn)組中，與術(shù)前比較，術(shù)

9、后12周及24周，主動(dòng)、被動(dòng)最大開(kāi)口度也均明顯變小，也均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p均為0.000）；相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，螺旋CT水平面的骨融合面積均與主、被動(dòng)最大開(kāi)口度呈負(fù)相關(guān)（p均為0.000），水平面的骨融合面積是影響最大開(kāi)口度的獨(dú)立因素(主動(dòng)最大開(kāi)口度和面積，12周:r=-0.940,p=0.000;24周:r=-0.952,p=0.000;被動(dòng)最大開(kāi)口度和面積，12周:r=-0.944;p=0.000;24周:r=-0.953;p=0.000

10、).
　　結(jié)論：創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)骨強(qiáng)直中，張口受限是診斷TMJ骨性強(qiáng)直的重要指標(biāo)；水平面CT上的骨融合面積是評(píng)價(jià)TMJ骨性強(qiáng)直后開(kāi)口度受限程度的重要指標(biāo)，即骨融合區(qū)面積越大，最大開(kāi)口度越小，TMJ骨性強(qiáng)直越嚴(yán)重。
　　實(shí)驗(yàn)三、翼外肌在創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直發(fā)生中的作用---影像學(xué)研究
　　目的：通過(guò)Micro-CT觀察翼外肌在SFMC(髁突矢狀骨折)后創(chuàng)傷性TMJ骨強(qiáng)直中的作用。
　　方法：以實(shí)驗(yàn)一的動(dòng)物標(biāo)本作

11、為研究對(duì)象。通過(guò)顯微 CT觀察關(guān)節(jié)復(fù)合體形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV),骨小梁厚度（Tb.Th),骨小梁數(shù)量（Tb.N）,骨小梁間隙（Tb.SP）和骨小梁各向異性程度（DA）等骨微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)的變化。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組只有纖維粘連而對(duì)照組在關(guān)節(jié)外側(cè)發(fā)生了骨性強(qiáng)直，與實(shí)驗(yàn)組比較，對(duì)照組所有關(guān)節(jié)標(biāo)本的上下關(guān)節(jié)面新生骨呈鋸齒狀伸向關(guān)節(jié)間隙，且關(guān)節(jié)間隙變窄，內(nèi)可見(jiàn)不規(guī)則鈣化影像，髁突呈內(nèi)外向“Y”型分叉。術(shù)后12周及24周，對(duì)

12、照組髁突內(nèi)外徑及前后徑較實(shí)驗(yàn)組明顯增大。骨折區(qū)骨結(jié)構(gòu)參數(shù)BV/TV,Tb.Th,Tb.N隨時(shí)間推移而增加，Tb.SP和DA呈降低趨勢(shì)，兩組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（12周,BV/TV,Tb.Th, Tb.N,Tb.SP和DA分別為p=0.002,0.011,0.000,0.000,0.000;24周, BV/TV,Tb.Th,Tb.N, Tb.SP和DA分別為p=0.024,0.000,0.000,0.002,0.000），對(duì)照組骨折區(qū)新生

13、骨小梁的主要方向與翼外肌的收縮方向一致。實(shí)驗(yàn)組各參數(shù)隨時(shí)間變化不明顯，新生骨小梁的主要方向與翼外肌的收縮方向不一致。
　　結(jié)論：翼外肌在髁突矢狀骨折后發(fā)生TMJ骨性強(qiáng)直過(guò)程中具有類(lèi)牽張成骨作用，保留翼外肌功能組有更多新骨生成。
　　實(shí)驗(yàn)四、翼外肌在創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直發(fā)生中的作用---組織學(xué)研究
　　目的：通過(guò)組織學(xué)觀察LPM（翼外?。┰赟FMC(髁突矢狀骨折)后創(chuàng)傷性TMJ骨強(qiáng)直中的作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)一

14、的標(biāo)本作為研究對(duì)象。關(guān)節(jié)復(fù)合體通過(guò)冠狀面分為前中后三塊，取中間組織塊用5％過(guò)氧化苯甲酰聚合包埋，用硬組織切片機(jī)制備成25微米厚硬組織切片進(jìn)行VG染色和麗春紅染色，通過(guò)組織學(xué)方法觀察關(guān)節(jié)復(fù)合體微觀解剖結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：術(shù)后12周，24周，對(duì)照組所有關(guān)節(jié)標(biāo)本的上下關(guān)節(jié)面發(fā)生骨性粘連，均有新生骨呈鋸齒狀長(zhǎng)入關(guān)節(jié)間隙，關(guān)節(jié)間隙內(nèi)可見(jiàn)大量成軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)，尤其在關(guān)節(jié)外側(cè)面可見(jiàn)大量新生軟骨、軟骨橋及新生軟骨化骨。冠狀面切片仍可見(jiàn)髁突呈內(nèi)外

15、向“Y”型分叉，骨折區(qū)新生骨明顯增多，新生骨小梁整體趨向于某一方向,與翼外肌的收縮方向基本一致。隨時(shí)間推移，對(duì)照組關(guān)節(jié)間隙及骨折區(qū)新生骨越來(lái)越多，關(guān)節(jié)間隙越來(lái)越窄。實(shí)驗(yàn)組關(guān)節(jié)間隙可見(jiàn)大量的纖維組織，未見(jiàn)新生軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)，骨折區(qū)發(fā)生了改建趨近于正常。
　　結(jié)論：創(chuàng)傷性TMJ骨性強(qiáng)直的始發(fā)以軟骨化骨為主；翼外肌作用使SFMC區(qū)成骨活性增強(qiáng)，翼外肌具有類(lèi)牽張成骨作用。
　　實(shí)驗(yàn)五、翼外肌在創(chuàng)傷性顳下頜關(guān)節(jié)骨性強(qiáng)直發(fā)生中的作用

16、--分子生物學(xué)初步研究
　　目的：探討創(chuàng)傷性TMJ骨性強(qiáng)直中SFMC（髁突矢狀骨折）區(qū)的分子變化。
　　方法：以15只綿羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物（從001~015編號(hào)），其中3只為空白對(duì)照，不做任何處理，分別于2、4和12周各處死1只動(dòng)物。其它12只綿羊分組及手術(shù)步驟同實(shí)驗(yàn)一，分別于術(shù)后2、4和12周各處死4只動(dòng)物，通過(guò)RT-qPCR及免疫組化染色方法檢測(cè)成骨相關(guān)因子COL1（I型膠原）、OCN（骨鈣蛋白）及TGF-β1（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β

17、1）基因和蛋白水平差異。
　　結(jié)果：RT-qPCR定量分析：術(shù)后2、4和12周，對(duì)照組COL1, OCN及TGF-β1的mRNA表達(dá)量顯著高于實(shí)驗(yàn)組（COL1:2周:p=0.008;4周:p=0.007;12周:p=0.001；TGF-β1和OCN:2周、4周和12周,p均為0.000）；隨時(shí)間變化，對(duì)照組TGF-β1和OCN的mRNA表達(dá)量呈上升趨勢(shì)（p均為0.000）；COL1 mRNA表達(dá)呈先上升后降低趨勢(shì)（p=0.000）

18、，而實(shí)驗(yàn)組均呈先升高后降低（p=0.000）。免疫組化結(jié)果：術(shù)后2周、4周和12周，對(duì)照組SFMC區(qū)成骨細(xì)胞TGF-β1和COL1的表達(dá)量明顯高于實(shí)驗(yàn)組（TGF-β1:2周:p=0.006;4周:p=0.000;12周:p=0.000;COL1:2周:p=0.000;4周:p=0.000;12周:p=0.001）；隨時(shí)間變化，對(duì)照組SFMC區(qū)成骨細(xì)胞TGF-β1和COL1的表達(dá)均增高（COL1:p=0.001;TGF-β1:p=0.00

19、3）；相反，成軟骨細(xì)胞COL1和TGF-β1的表達(dá)量隨時(shí)間變化呈降低趨勢(shì)（TGF-β1:p=0.000;COL1:p=0.000）。OCN的表達(dá)結(jié)果：術(shù)后2周、4周和12周，對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)組表達(dá)量也增高（2周:p=0.016;4周:p=0.004;12周：p=0.004）。隨時(shí)間推移，對(duì)照組逐漸增高（p=0.000），而實(shí)驗(yàn)組呈先升高后降低趨勢(shì)（p=0.000）。
　　結(jié)論:翼外肌的類(lèi)牽張成骨作用使骨折區(qū)成骨活性明顯增強(qiáng)，是發(fā)生創(chuàng)傷