氟胞嘧啶耐藥基因篩選及其機(jī)制研究.pdf

1、抗真菌藥物耐藥性已成為亟需解決的全球性難題，耐藥性引起的死亡率較高且難以治療，也是臨床抗真菌藥物治療失敗的主要原因。所以深入研究真菌耐藥機(jī)制并能控制和解決其耐藥性的發(fā)生，對(duì)國(guó)民的身體健康和社會(huì)的和諧發(fā)展有著非常重要的意義。臨床真菌對(duì)氟胞嘧啶（5-FC）易產(chǎn)生耐藥性，但機(jī)制非常復(fù)雜，本文試圖開展該藥物耐藥性新機(jī)制研究。
　　首先，在對(duì)5-FC耐藥菌株的篩選以及之后SDS-PAGE對(duì)高耐藥性菌株酵母總蛋白表達(dá)特性分析進(jìn)行初步探索之后，

2、我們發(fā)現(xiàn)抗性菌株相比于野生型菌株蛋白含量明顯發(fā)生改變，但是通過誘變篩選的菌株對(duì)5-FC耐受性不具有特異性，特別是所得到的5-FC高耐受性菌株蛋白水平所表現(xiàn)出的差異可能是許多不同的基因共同調(diào)節(jié)的結(jié)果。為了篩選出對(duì)5-FC有特異耐受性的靶向基因，我們用過表達(dá)基因庫(kù)來篩選特異性抗5-FC的靶向基因，以期尋找5-FC耐受機(jī)制新途徑。
　　其次，我們通過釀酒酵母必需基因過表達(dá)庫(kù)的篩選，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ScGFA1基因后明顯提高了細(xì)胞對(duì)5-FC的耐

3、受性。已知GFA1基因參與了細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)的合成，首先用卡爾科弗盧爾熒光增白劑(CFW)染色法和熒光分光光度計(jì)檢測(cè)了細(xì)胞中幾丁質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ScGFA1提高了細(xì)胞中幾丁質(zhì)的合成，而5-FC處理后細(xì)胞中幾丁質(zhì)含量明顯下降。我們推測(cè)過表達(dá)ScGFA1對(duì)5-FC耐藥性的原因可能與細(xì)胞中幾丁質(zhì)的合成有關(guān)。為此，進(jìn)一步克隆構(gòu)建了細(xì)胞幾丁質(zhì)合成代謝途徑相關(guān)的一系列基因CRH1，GNA1,CHS2,PCM1,QRI1和CDA1，發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母野

4、生型菌株中過表達(dá)這些基因?qū)?-FC也具有耐受性。值得注意的是幾丁質(zhì)合成酶缺失突變體chs1Δ, chs3Δ對(duì)5-FC非常敏感，意味著幾丁質(zhì)的合成與5-FC的耐受性具有密切的相關(guān)性。此外我們?cè)趲锥≠|(zhì)合成代謝的補(bǔ)救途徑中添加葡萄糖胺(Glc-N)，發(fā)現(xiàn)其可以使野生型菌株 BY4741對(duì)5-FC具有耐受性，而ScGFA1過表達(dá)菌株對(duì)5-FC的耐受性受到抑制。
　　此外，我們發(fā)現(xiàn)甘露糖蛋白合成代謝也影響幾丁質(zhì)的合成，但其途徑十分復(fù)雜至今還

5、不清楚。我們觀察到甘露糖蛋白合成相關(guān)的某些基因CWP2,VRG1and MNT2的缺失也增加了幾丁質(zhì)的合成。而甘露糖蛋白合成相關(guān)缺失突變體cwp2Δ,vrg1Δ和 mnt2Δ過表達(dá)ScGFA1也對(duì)5-FC具有耐受性。通過進(jìn)一步克隆構(gòu)建甘露糖蛋白合成相關(guān)基因CWP2,VRG4和MNT2，發(fā)現(xiàn)上調(diào)甘露糖蛋白的合成也能產(chǎn)生對(duì)5-FC的耐受性。最后我們利用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)了細(xì)胞中糖核苷酸UDP-GLC的含量，發(fā)現(xiàn)5-FC處理后細(xì)胞

6、中UDP-GLC的含量明顯增加，結(jié)合前期我們發(fā)現(xiàn)的5-FC能降低細(xì)胞中幾丁質(zhì)的合成，因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5-FC可能通過抑制細(xì)胞壁中糖核苷酸的分解，進(jìn)一步導(dǎo)致了細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量的下降，而過表達(dá)ScGFA1可以抵抗和彌補(bǔ)5-FC造成的這種損失。
　　最后在釀酒酵母中異源表達(dá)致病酵母白色念珠菌的CaGFA1，發(fā)現(xiàn)其對(duì)5-FC的耐受性同樣存在，并且白色念珠菌經(jīng)5-FC處理后，細(xì)胞中幾丁質(zhì)含量也明顯下降。因此過表達(dá)GFA1賦予5-FC的耐受