沙利度胺、5-氟脲嘧啶對胃癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、背景: 胃癌在我國的發(fā)病率和死亡率在各種惡性腫瘤中居首位，由于胃癌早期并無特異性表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時大多數(shù)病人已處于中晚期。胃癌的治療效果差強(qiáng)人意，化療是目前治療胃癌的主要手段之一，近年來雖然開發(fā)研制了不少抗腫瘤新藥，但于胃癌時有效的很少，5-氟脲嘧啶(5-Fu)仍是胃癌化療的主要藥物之一。臨床上常通過加大藥物的劑量或多藥物聯(lián)合來增加敏感性，但由于胃癌對化療藥物大多為低敏感性，故雖然高劑量藥物在一定程度上能提高療效，然而劑量增大對正常組

2、織(如骨髓、心臟及肝臟等)的毒性也會增加，耐受性降低使療效反而得不到提高，因而對胃癌患者的化療中，適量聯(lián)合使用其它類藥物通過協(xié)同作用于腫瘤細(xì)胞，減少化療藥物臨床用藥劑量，降低其副作用，一直是腫瘤藥物治療的研究熱點(diǎn)之一。沙利度胺(商品名：反應(yīng)停)作為早孕反應(yīng)的治療藥物曾因引起胎兒肢體和內(nèi)臟畸形而退市，但新的研究發(fā)現(xiàn)沙利度胺有抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)及誘導(dǎo)凋亡作用，使該藥物重新得到重視，并已用于炎癥和腫瘤性疾病。現(xiàn)在對沙利度胺的作用機(jī)制仍所知甚

3、少。 本研究的目的是探討沙利度胺單藥、5-Fu單藥及沙利度胺和5-Fu聯(lián)合應(yīng)用對MGC-803細(xì)胞株的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用及對凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法: 首先做出不同密度細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線，采用1×103、1×104、5×104、1×105、1×106/ml不同密度的MGC-803細(xì)胞接種于96孔板，每孔100 μl，設(shè)6個復(fù)孔，次日加入100 μ l培養(yǎng)液作為模擬加藥開始計(jì)時，于24、48、72、96

4、、120小時動態(tài)進(jìn)行MTT檢測，選出觀察時間內(nèi)適宜的初始接種密度。根據(jù)第一步實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以后的實(shí)驗(yàn)組均采用4×104/ml密度接種，次R加入實(shí)驗(yàn)用藥開始計(jì)時，于24、48小時進(jìn)行MTT檢測。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果及所加藥物的不同，實(shí)驗(yàn)組分為5個沙利度胺單藥組，培養(yǎng)體系中藥物濃度分別為6.25、12.5、25、50、100 μ g/ml(其中二甲基亞楓(DMSO)作為沙利度胺的溶劑，在培養(yǎng)體系中最大濃度為0.1％)；4個5-Fu單藥組，培養(yǎng)體系中

5、藥物濃度分別為6.25、12.5、25、50 μ g/ml；4個聯(lián)合用藥組，培養(yǎng)體系中藥物濃度分別為5-Fu 25 μ g/ml+沙利度胺50 μ g/ml組、5-Fu 25μg /ml+沙利度胺100 μ g/ml組、5-Fu 12.5 μg/ml+沙利度胺50 μ g/ml組、5-Fu 12.5 μ g/ml+沙利度胺100 μ g/ml組；空白對照組僅加入含0.1％DMSO的培養(yǎng)液代替藥物作用于細(xì)胞，另設(shè)不加細(xì)胞的試劑對照以排除各

6、種試劑對MTT檢測的影響，各組均設(shè)4個復(fù)孔。用藥后采用活細(xì)胞倒置相差顯微鏡觀察、HE染色法光學(xué)顯微鏡觀察、丫啶橙(AO)/溴化乙錠(EB)染色熒光顯微鏡觀察MGC-803細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，MTT法、流式細(xì)胞術(shù)(FACs)定量檢測沙利度胺單藥、5-Fu單藥及二者聯(lián)合應(yīng)用對MGC-803細(xì)胞株的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡作用，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測凋亡相關(guān)基因-過氧化物酶體增殖劑活化受體(P P A R-γ)和B c l-2表達(dá)的變化。 結(jié)果:

7、在72小時之內(nèi)，細(xì)胞初始接種密度為1×103-5×104/ml時，隨時間延長，細(xì)胞呈線性關(guān)系生長，均為本實(shí)驗(yàn)適宜的細(xì)胞初始接種密度，為細(xì)胞制懸時計(jì)算方便，最終選擇4×104/mL為實(shí)驗(yàn)用96孔板的細(xì)胞初始接種密度。細(xì)胞初始接種密度為1×103/ml時，細(xì)胞在120小時內(nèi)呈良好的線性關(guān)系生長，可用以長時間的研究。在倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞數(shù)隨沙利度胺、5-Fu的濃度增加而減少，雙藥聯(lián)合組細(xì)胞數(shù)減少更明顯，上清液混濁，貼壁細(xì)胞欠透亮，可見凋亡

8、細(xì)胞，其胞質(zhì)固縮，體積明顯縮小，整體呈圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮及破碎；在光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色的爬片可見，實(shí)驗(yàn)組中的細(xì)胞因增殖受抑制而稀疏，可見凋亡細(xì)胞，其胞質(zhì)固縮，體積明顯縮小，整體呈圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核染色質(zhì)濃染或形成染色質(zhì)塊，染色質(zhì)塊凝集在核的邊緣呈半月形或相互分離形成多個核碎片，有的細(xì)胞膜起泡脫落形成凋亡小體；熒光顯微鏡下，沙利度胺、5-Fu各濃度組和雙藥聯(lián)合組均見凋亡細(xì)胞，細(xì)胞呈固縮狀或圓珠狀，染色質(zhì)呈橘紅色凝集分

9、布于核膜內(nèi)側(cè)，可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。在MTT分析中，在沙利度胺單藥組，不同濃度沙利度胺均可抑制MGC-803細(xì)胞株增殖，且細(xì)胞增殖受抑率隨藥物濃度的增高和時間的延長而上升，24小時時各組細(xì)胞增殖受抑率0.7％、1.4％、5.6％、15.0％和18.1％，48小時時各組細(xì)胞增殖受抑率0.8％、2.7％、7.3％、14.7％和18.9％，藥物濃度≥25 μ g/ml的各組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05，P＜0.01)，沙利

10、度胺6.25μ g/ml、12.5 μ g/ml組與對照組相比無顯著性差異(P＞0.05)，兩組之間亦無顯著性差異(P＞0.05)；其中藥物作用24小時時，沙利度胺50 μ g/ml、100 μ g/ml組之間無顯著性差異(P＞0.05)，但延長作用至48小時時，二者之間出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)。在5-Fu單藥組，藥物作用24小時與48小時時，細(xì)胞增殖受抑率在各濃度組與對照組相比均有顯著性差異(P＜0.01)，其中藥物作用24小時

11、時，各組兩兩比較時6.25 μg/ml與12.5 μg/ml組、25 μg/ml與50 μg/ml組無顯著性差異(P＞0.05)，但作用至48小時時，各組兩兩比較均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)。在聯(lián)合用藥組，在5-Fu劑量均為25 μg/ml時，聯(lián)合用藥組與相應(yīng)的5-Fu單藥組相比均出現(xiàn)顯著性差異(P＜0.01)，但兩個聯(lián)合用藥組之間無顯著性差異(P＞0.05)；在5-Fu劑量均為12.5 μg/ml時，聯(lián)合使用沙利度胺50或100

12、μg/ml時與5-Fu 25 μg/ml單藥組相比均無明顯差別(P＞0.05)。在FACs中沙利度胺組藥物濃度分為12.5、50 μg/ml，5-Fu組為25 μg/ml，聯(lián)合用藥組為5-Fu25 μg/ml+沙利度胺50 μg/ml，空白對照組為含DMSO0.05％的培養(yǎng)液代替藥物，以上各組凋亡率分別為3.31％、6.7％、13.3％、19.2％、1.05％，各實(shí)驗(yàn)組與空白對照組相比，凋亡率均有顯著性差異(P＜0.01)，各實(shí)驗(yàn)組兩兩

13、比較，凋亡率亦均有顯著性差異(P＜0.01)。 在免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析中，應(yīng)用沙利度胺12.5、50 μg/ml、5-Fu 25 μg/ml、5-Fu 25 μg/ml十沙利度胺50 μg/ml作用于MGC-803細(xì)胞株48小時后，與空白對照組相比P P A R-Y表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少(P＜0.01)，聯(lián)合用藥組和單藥組之間亦有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論: 沙利度胺單藥、5-Fu單藥對MGC-80

14、3細(xì)胞株均有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，其作用明顯增強(qiáng)，而且聯(lián)合使用沙利度胺時可降低5-Fu的使用劑量。 意義: 沙利度胺對血管生成的抑制作用已被廣泛關(guān)注，對實(shí)體瘤誘導(dǎo)凋亡的作用正處于研究熱點(diǎn)之中。雖然沙利度胺的作用機(jī)制仍不是很清楚，但實(shí)驗(yàn)研究都顯示該藥能有效抑制腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，并取得了令人鼓舞的結(jié)果。沙利度胺無骨髓抑制作用，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以提高療效，盡管沙利度胺對各種腫瘤的療效并不一致，相