石上柏乙酸乙酯部位抗喉癌活性及黃酮類成分的研究.pdf

1、石上柏是一種常用中草藥及我國南方多民族用藥，為卷柏科卷柏屬植物深綠卷柏Selaginella doederlernii Hieron.的干燥全草，多?。▍^(qū)）、市地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)均有收載。該品種具有清熱解毒、抗癌等功效，常用于治療咽喉腫痛、呼吸道炎癥、濕熱黃疸以及肺癌、鼻咽癌、喉癌、肝癌等多種癌癥。課題組前期實(shí)地調(diào)查及初步藥理研究發(fā)現(xiàn)，石上柏的抗喉癌作用顯著，其乙酸乙酯部位活性最強(qiáng)。在此基礎(chǔ)上，筆者對石上柏乙酸乙酯萃取部位體外抑制人喉癌 H

2、ep-2細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制進(jìn)行了初步研究探索，并對該有效部位進(jìn)行了化學(xué)成分的分離純化，進(jìn)一步研究探索了其藥理作用的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)；還通過紫外-可見分光光度法（UV-Vis）和高效液相色譜法（HPLC）測定了石上柏及同屬的另外5種植物藥中活性物質(zhì)黃酮類成分的含量，為它們的質(zhì)量評價(jià)及質(zhì)量控制提供了可靠的分析方法，并初步確定了其中5種植物藥的最佳采收期。
　　本研究采用四氮唑鹽還原法（MTT法）、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法、流式細(xì)胞術(shù)及免疫印跡法

3、（Western blot）初步探討石上柏乙酸乙酯萃取部位（SDO-EtOAC）對人喉癌Hep-2細(xì)胞的抗腫瘤活性及其機(jī)制。結(jié)果表明，SDO-EtOAC可明顯抑制Hep-2細(xì)胞的體外增殖，并呈現(xiàn)劑量和時(shí)間雙重依賴性；倒置顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，如邊緣不規(guī)則，貼壁能力下降，染色質(zhì)固縮等；流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，SDO-EtOAC可使Hep-2細(xì)胞周期阻滯于S期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且凋亡率隨著給藥濃度的升高而增加；Wes

4、tern blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，隨著給藥劑量的逐漸增加，Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表達(dá)量增加，而Bcl-2則減少，表明其凋亡機(jī)制可能與上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)量，從而降低Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)比例，以及激活Caspase-9、Caspase-3有關(guān)。
　　利用柱層析、半制備高效液相色譜等分離純化手段對石上柏乙酸乙酯部位的黃酮類成分進(jìn)行研究，共分離得到9個(gè)化合物，根據(jù)化合物的理化性質(zhì)

5、及波譜特征，鑒定其中6個(gè)化合物為：7,4′,7′′,4′′′-四甲氧基穗花杉雙黃酮（1），橡膠樹雙黃酮（2），2′′,3′′-dihydroochnaflavone（3），chrysocauloflavone I（6），穗花杉雙黃酮（7），delicaflavone（9），化合物（3）為首次從石上柏中分離得到。這些研究結(jié)果為后續(xù)的具體雙黃酮化合物的抗腫瘤活性研究、進(jìn)一步明確石上柏的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)奠定了基礎(chǔ)。
　　采用UV-Vis法及

6、HPLC法分別測定了石上柏及另外5種卷柏屬植物藥中總黃酮及穗花杉雙黃酮的含量，并比較了不同采收期黃酮類成分的含量變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種卷柏屬植物藥中二者含量差異顯著；江南卷柏（S. moellendorffii）、薄葉卷柏（S. delicatula)、翠云草（S. uncinata)、疏葉卷柏（S. remotifolia）和異穗卷柏（S. heterostachys）中總黃酮及穗花杉雙黃酮的含量在夏秋二季呈現(xiàn)不同的變化趨勢。綜合考慮后