小立碗蘚PpCalS12與NPR1基因定點(diǎn)敲除的初步研究.pdf

1、小立碗蘚是研究植物功能基因的新模式植物。小立碗蘚同源重組率高以及基因組序列測(cè)定完成，使得利用基因打靶技術(shù)對(duì)其特定基因的功能進(jìn)行研究成為可能。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)，PpCalS12基因和NPR1基因可能與小立碗蘚抵抗灰霉菌感染有關(guān)。為進(jìn)一步證實(shí)PpCalS12基因和NPR1基因的作用機(jī)理，本研究主要開(kāi)展了以下工作：1、對(duì)影響構(gòu)建敲除載體的重要因素——如何提高E.coliDH5α的轉(zhuǎn)化率做了準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。2、構(gòu)建PpCalS12基因和NPR1

2、基因的敲除載體。3、利用PEG介導(dǎo)法培育缺失PpCalS12基因的突變植株。
　　通過(guò)研究取得了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、使用過(guò)濾處理的CaCl2比滅菌處理的CaCl2制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率高；其他條件相同，長(zhǎng)期保存的大腸桿菌菌種活化三次以上的轉(zhuǎn)化率最高；其他條件相同，制備感受態(tài)細(xì)胞第一次離心使用4℃、4000g離心15min，第二次離心時(shí)使用4℃、4000g離心5min得到的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高。2、實(shí)驗(yàn)以pTN182載體、小立碗蘚P

3、pCalS12和NPR1基因的上、下游同源臂PCR產(chǎn)物為基礎(chǔ)材料，通過(guò)酶切、連接等方法構(gòu)建出PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2和NPR1.1-pTN182-NPR1.2敲除載體。PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2和NPR1.1-pTN182-NPR1.2載體的酶切驗(yàn)證與預(yù)期片段大小基本相符。構(gòu)建的PpCalS12.1-pTN182-PpCalS12.2 PpCalS12載體測(cè)序結(jié)果與目的片段相

4、似度為99.10％，NPR1.1-pTN182-NPR1.2載體與目的片段相似度為99.23%。3、利用PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化PpCalS12基因，兩次G418抗性篩選后得到8株再生植株。
　　通過(guò)本實(shí)驗(yàn)：1、掌握了E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的優(yōu)化條件。2、成功構(gòu)建了小立碗蘚PpCalS12和NPR1基因的敲除載體。3、得到了小立碗蘚突變植株，其中可能含有缺失PpCalS12基因的突變植株。這些為進(jìn)一步研究PpCalS12和N