灰霉菌GFP轉(zhuǎn)化子致病力分析及其與小立碗蘚互作體系的建立.pdf

1、灰霉菌具有廣寄主、耐低溫、致病力強(qiáng)等特點(diǎn)，是一種重要的植物采后致病菌。菌株0023是一株分離自葡萄的灰霉菌，具有大量產(chǎn)孢的特性。本文以灰霉菌0023為材料，試驗(yàn)優(yōu)化了聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，建立了適于灰霉菌0023的轉(zhuǎn)化體系，并對轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行詳細(xì)描述。使用此法獲得了攜帶熒光標(biāo)記且致病力穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子用于果實(shí)及小立碗蘚侵染，發(fā)現(xiàn)小立碗蘚具有良好的感病性，同時小立碗蘚具有易于培養(yǎng)、世代交替明顯和遺傳信息明確的優(yōu)勢，是

2、難得的用于病害互作研究的寄主材料。我們建立了灰霉菌與小立碗蘚的病害互作體系，在熒光顯微鏡下觀察灰霉菌熒光轉(zhuǎn)化予侵染舉動時，該病害互作體系具有明顯優(yōu)勢。
　　 主要結(jié)果如下：
　　 1.PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法能夠用于灰霉菌0023的轉(zhuǎn)化。濃度為15mg/mLLysing enzyme(Sigma L1412-25G)酶解液，25℃，100rpm，2h為制備原生質(zhì)體最適酶解條件。
　　 2.40％PEG3350用

3、于轉(zhuǎn)化，0.6M KCl高滲溶液及20％蔗糖濃度的SHA適于灰霉菌0023原生質(zhì)體復(fù)蘇，復(fù)蘇時間為2周，復(fù)蘇率為30％。
　　 3.啟動子Olic和終止子Trpc適于外源基因在灰霉菌0023體內(nèi)表達(dá)，每次轉(zhuǎn)化需要量為1μg外源基因，用于107個/mL原生質(zhì)體。以此法獲得轉(zhuǎn)化子比率為1/106。
　　 4.熒光轉(zhuǎn)化子G1在激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，常溫下培養(yǎng)5d長滿平皿，第5d產(chǎn)孢量為4.25104個/cm2，第3d乙烯釋放量

4、為1.19μL/h，低溫對其生長影響不大，能夠侵染葡萄及小立碗蘚。以果實(shí)為寄主，不利于熒光轉(zhuǎn)化子侵染舉動觀察。
　　 5.以BCDATG培養(yǎng)基培養(yǎng)的小立碗蘚，滴加100μL灰霉菌孢子懸浮液，濃度為107個/mL，可導(dǎo)致小立碗蘚迅速發(fā)病，病程為2周。
　　 6.能導(dǎo)致苔蘚萎蔫的病原真菌總狀毛霉也能夠?qū)е滦×⑼胩\萎蔫，這是總狀毛霉作為苔蘚病原菌的首次報道。
　　 7.小立碗蘚能夠感受灰霉菌、總狀毛霉及鐮刀菌侵染，分別