Fe2+對(duì)紅球菌R04 CYP125A18與唑類藥物相互作用的影響.pdf

1、細(xì)胞色素P450單加氧酶( cytochrome P450)是一類含有鐵血紅素的單加氧超家族，分布十分廣泛，如細(xì)菌、真菌和高等生物中，具有轉(zhuǎn)化內(nèi)源性物質(zhì)(如膽固醇、類固醇、脂肪等)和催化外源性物質(zhì)(如藥物、環(huán)境物質(zhì))的功能。在原核生物中，CYP450表現(xiàn)出豐富的多樣性，如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的CYP家族有20個(gè)細(xì)胞色素P450單加氧酶，其中CYP125是膽固醇分解代謝起始的關(guān)鍵酶，可以解除

2、4-膽甾烯-3-酮的毒性，且唑類藥物對(duì)其有明顯的結(jié)合抑制作用。紅球菌( Rhodococcus sp.) R04基因組有15種細(xì)胞色素P450單加氧酶，其中CYP125A18與結(jié)核分枝桿菌和馬紅球菌( Rhodococcus equi)的CYP125有較高同源性。
　　本研究對(duì)CYP125A18基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，通過純化過程中添加Fe2+，獲得了含外源鐵的CYP125A18-Fe；并用紫外分光光度法對(duì)兩種蛋白的光譜特性以及與底物

3、、唑類藥物互作情況進(jìn)行分析，測(cè)定了兩種蛋白的圓二色光譜且與底物、唑類藥物結(jié)合后兩種蛋白圓二色光譜的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，氧化態(tài)CYP125A18血紅素鐵大部分是低自旋狀態(tài)，少部分為高自旋狀態(tài)，而氧化態(tài)的CYP125A18-Fe血紅素鐵幾乎全部是高自旋狀態(tài)； CYP125A18還原態(tài)和 CO結(jié)合后與CYP125A18氧化態(tài)的差示光譜表現(xiàn)為典型的CYP450光譜特性；CYP125A18-Fe蛋白也有類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但450nm處吸收較CYP1

4、25A18弱。CYP125A18與底物4-膽甾烯-3-酮結(jié)合后，血紅素鐵全部轉(zhuǎn)變?yōu)楦咦孕隣顟B(tài)，CYP125A18-Fe與底物4-膽甾烯-3-酮結(jié)合后，紫外光譜發(fā)生明顯改變，部分血紅素鐵恢復(fù)低自旋狀態(tài)。
　　在對(duì)兩種蛋白的圓二色光譜的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，CYP125A18、CYP125A18-Fe蛋白的圓二色光譜沒有明顯差異，說明Fe2+沒有影響蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)兩種蛋白與底物4-膽甾烯-3-酮結(jié)合后測(cè)定的圓二色光譜，與蛋白的圓二色光譜計(jì)

5、算所得的二級(jí)結(jié)構(gòu)數(shù)目對(duì)比發(fā)現(xiàn)數(shù)值基本一致，說明CYP125A18與底物結(jié)合后其二級(jí)結(jié)構(gòu)基本不發(fā)生改變，且Fe2+基本不影響蛋白與底物的結(jié)合。兩種蛋白與唑類藥物結(jié)合后的圓二色光譜計(jì)算所得的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生α螺旋向β折疊的轉(zhuǎn)變，說明唑類藥物改變了兩種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，且三唑類藥物對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響更為劇烈；但兩種蛋白的圓二色光譜差別不明顯，說明Fe2+的加入對(duì)蛋白與唑類藥物的結(jié)合基本沒有影響。
　　CYP125A18與唑類藥物滴定后發(fā)生了

6、II型光譜轉(zhuǎn)變，CYP125A18蛋白與唑類藥物結(jié)合的解離常數(shù)表明，七種唑類藥物與CYP125A18的親和力由強(qiáng)到弱依次為酮康唑、益康唑、4-苯基咪唑、氟康唑、4-甲基-2-苯基咪唑、克霉唑、甲硝唑。CYP125A18-Fe蛋白與唑類藥物結(jié)合后，光譜變化明顯異于CYP125A18蛋白，在370nm和415nm左右的吸收均有增加，但差譜變化量與CYP125A18差異不大，計(jì)算所得與七種唑類藥物的結(jié)合常數(shù)所展示的親和力由強(qiáng)到弱的順序與CYP