非編碼RNA干預(yù)手段治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.為了驗證miR-23b海綿表達(dá)慢病毒載體對miR-23b的表達(dá)水平、miR-23b靶蛋白VHL相關(guān)的下游信號通路和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞體內(nèi)外促血管生成、侵襲及遷移能力的抑制作用。
　　2.為了探索SNORD76與HOTAIR表達(dá)改變之間的關(guān)系、在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的功能及可能的作用機(jī)制、過表達(dá)SNORD76對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤裸鼠原位模型的影響及SNORD76在不同級別膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況。
　　方法：

2、　　1.用表達(dá) miR-23b海綿的慢病毒載體感染膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 U87-MG、LN229和U251后，利用定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)miR-23b表達(dá)水平變化、Western blot技術(shù)檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達(dá)變化，采用體外血管形成模擬實驗、Transwell實驗及劃痕實驗分別檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤促血管形成、侵襲和遷移相關(guān)惡性表型的變化。
　　2.建立膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG裸鼠原位瘤模型，利用小動物活體成像系統(tǒng)實時監(jiān)測

3、原位移植瘤的生長速度，免疫組織化學(xué)染色檢測VHL及其下游信號通路蛋白的表達(dá)變化、CD31染色檢測新生血管情況及H&E染色檢測腫瘤組織向非腫瘤組織侵襲或遷移的情況。
　　3.利用定量 PCR技術(shù)分別檢測實驗室常規(guī)培培養(yǎng)細(xì)胞系 U87-MG、U87-EGFRvIII、LN229、U251和SNB19中HOTAIR、SNORD76和GAS5的基礎(chǔ)表達(dá)水平，利用表達(dá)HOTAIR siRNA和全長序列慢病毒載體分別感染高表達(dá)和低表達(dá)HOTA

4、IR的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系后，檢測HOTAIR、SNORD76和GAS5的表達(dá)變化。
　　4.分別對低表達(dá)和高表達(dá)SNORD76的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系采用SNORD76過表達(dá)慢病毒處理和SNORD76 siRNA處理后，分別利用MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖能力的改變。
　　5.利用 PI染色流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測過表達(dá) SNORD76對細(xì)胞周期的影響，隨后Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的改

5、變。
　　6.建立SNORD76過表達(dá)組和對照組的U87-MG裸鼠膠質(zhì)母細(xì)胞瘤原位模型，利用小動物成像系統(tǒng)監(jiān)測原位移植瘤的生長情況，利用免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。
　　7.定量PCR技術(shù)檢測WHO分級II級膠質(zhì)瘤標(biāo)本20例、III級22例和IV級（膠質(zhì)母細(xì)胞瘤）21例中SNORD76和GAS5的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.定量PCR結(jié)果顯示在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)miR-23b海綿慢病毒可以抑

6、制～50％的miR-23b表達(dá)，而Western blot結(jié)果顯示與血管生成（VEGFA和HIF-1α）、侵襲和遷移（β-catenin、ZEB1、MMP2及MMP9）相關(guān)蛋白表達(dá)減少，而與侵襲和遷移能力負(fù)相關(guān)的蛋白VHL和E-cadherin表達(dá)增加，體外功能實驗結(jié)果提示 miR-23b海綿表達(dá)慢病毒抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤促血管生成、侵襲和遷移能力。
　　2.小動物活體成像結(jié)果證明 miR-23b海綿處理組原位移植瘤的生長速度較慢而裸

7、鼠平均生存期較長，免疫組織化學(xué)染色顯示CD31染色陽性新生血管的數(shù)量減少及腫瘤細(xì)胞向正常腦組織侵襲和遷移的細(xì)胞少，腫瘤與非腫瘤組織交界處較平滑，并且差異表達(dá)蛋白檢測結(jié)果同Western blot結(jié)果。
　　3. HOTAIR過表達(dá)組細(xì)胞中SNORD76表達(dá)減少，而HOTAIR siRNA處理組中SNORD76表達(dá)增加，GAS5的表達(dá)水平可能不受HOTAIR表達(dá)改變的影響。4. MTT實驗和軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明，過表達(dá) SNO

8、RD76抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖而敲低 SNORD76表達(dá)后促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖，過表達(dá)SNORD76的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期S期阻滯，而進(jìn)一步用Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白變化后發(fā)現(xiàn)Rb、pRb表達(dá)增加而cyclin A1、cyclin B1及p107表達(dá)降低。
　　5.膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87-MG裸鼠原位模型實驗結(jié)果表明，過表達(dá)SNORD76處理組原位瘤增大較對照組慢而裸鼠生存期較長，H&E染色結(jié)果說明處理組

9、腫瘤組織較對照組小，免疫組織化學(xué)檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)變化與Western blot中變化一致。
　　6.定量PCR技術(shù)檢測了不同級別膠質(zhì)瘤臨床標(biāo)本結(jié)果發(fā)現(xiàn)GAS5的表達(dá)在不同級別膠質(zhì)瘤中沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而SNORD76在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中特異性低表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1. miR-23b海綿通過提高miR-23b靶點蛋白VHL表達(dá)進(jìn)而抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的促血管生成、侵襲和遷移能力。
　　2.體內(nèi)實驗中過表達(dá)m