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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景:
多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma multiforme,GBM)是成人顱內(nèi)常見(jiàn)原發(fā)惡性腫瘤,由于腫瘤廣泛侵襲周圍正常腦組織,腫瘤全切困難。盡管通過(guò)手術(shù)、放療、化療等綜合治療手段,其預(yù)后仍然不佳,患者總體中位生存期在14-16個(gè)月。對(duì)于GBM侵襲的分子機(jī)制,國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究。受體酪氨酸激酶信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分子和細(xì)胞跨膜蛋白分子起了重要作用。
細(xì)胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(cyc
2、lin-dependent kinase-associatedphosphatase,KAP)通過(guò)Cdc2依賴的侵襲途徑促進(jìn)GBM的侵襲。KAP是一雙重特異性磷酸酶,通過(guò)去磷酸化Cdk2,抑制Cdk2的活性和細(xì)胞周期的進(jìn)展。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌中,KAP表達(dá)上調(diào)可增加腫瘤形成。假定KAP抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展,其上調(diào)增加腫瘤形成的機(jī)制難以解釋。來(lái)自于肝細(xì)胞癌的研究可能解釋這種現(xiàn)象,在肝細(xì)胞癌中,雖然KAP mRNA表達(dá)增加,但由于異常剪
3、接的KAP mRNA編碼缺乏Cdk2去磷酸化活性的KAP蛋白,導(dǎo)致大量無(wú)功能的KAP蛋白生成。在GBM中,KAP mRNA表達(dá)增加,但由于剪接異常,實(shí)際上產(chǎn)生大量無(wú)功能性KAP蛋白。KAP活性降低導(dǎo)致Cdc2表達(dá)上調(diào),同時(shí)應(yīng)用Cdc2抑制劑可拮抗GBM細(xì)胞的增殖和遷移過(guò)程。但是,KAP如何調(diào)節(jié)Cdc2依賴的GBM侵襲途徑,其詳細(xì)機(jī)制仍然未明。
除剪接外,基因表達(dá)的后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可影響KAP蛋白的表達(dá)。微小RNA(MicroRNA,
4、miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA,長(zhǎng)度一般為20-25個(gè)核苷酸,其通過(guò)與靶基因的mRNA3'UTR互補(bǔ)結(jié)合,影響蛋白的翻譯,因此,在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)基因的表達(dá)。MiRNA通過(guò)與增殖和侵襲的相關(guān)基因靶向性結(jié)合,調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此前報(bào)道,mir-26a基因在GBM中高表達(dá),其通過(guò)與PTEN、RB1、MEKK2等抑癌基因靶向結(jié)合,下調(diào)其表達(dá)促進(jìn)GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。在肺癌中miR-26a通過(guò)與PTEN的
5、3'UTR靶向性結(jié)合促進(jìn)肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移,這種現(xiàn)象也可能存在GBM細(xì)胞系中。但在鼻咽癌和肝細(xì)胞癌中,miR-26a可抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此,miR-26a對(duì)侵襲的作用具有組織特異性,miR-26a對(duì)GBM侵襲能力如何調(diào)節(jié),其在PTEN突變/缺失的GBM中的靶點(diǎn)和作用機(jī)制如何,國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
本文顯示miR-26a直接與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合,在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)KAP蛋白表達(dá)。同時(shí)KAP蛋白表達(dá)減少激活兩
6、條不同的途徑,最終導(dǎo)致Cdc2蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)GBM細(xì)胞的侵襲過(guò)程。一條途徑為KAP降低導(dǎo)致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Rac1依賴的侵襲途徑;另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2,CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的侵襲途徑。因此,miR-26a通過(guò)KAP/ROCK2/CDK2途徑促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲,我們發(fā)現(xiàn)驗(yàn)證miR-26a靶向性結(jié)合的新的基因位點(diǎn),這一調(diào)節(jié)在PTEN缺
7、失的GBM中發(fā)揮重要作用,同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)KAP在GBM侵襲中的作用和具體機(jī)制。
實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br> 細(xì)胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(KAP)通過(guò)Cdc2依賴的調(diào)節(jié)GBM細(xì)胞侵襲,然而,KAP調(diào)節(jié)Cdc2依賴侵襲通路的詳細(xì)機(jī)制仍然未明。我們通過(guò)KAP免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析的方法,篩選與KAP密切相關(guān)的Rho激酶家族成員ROCK1,ROCK2,ROCKβ,驗(yàn)證KAP/ROCK2/Rac1依賴性的GBM侵襲通路。同時(shí)阻斷上述通路并
8、不能完全阻斷GBM細(xì)胞的侵襲能力。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)KAP下調(diào)直接激活CDK2表達(dá)使Rb去磷酸化進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的侵襲途徑,驗(yàn)證KAP/CDK2/Cdc2侵襲途徑。同時(shí)檢測(cè)miR-26a在PTEN突變/缺失的GBM中的作用,通過(guò)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-26a能與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域結(jié)合,驗(yàn)證miR-26a是否在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)直接下調(diào)KAP蛋白表達(dá),通過(guò)上述通路激活Cdc2依賴的GBM侵襲途徑。
9、方法:
1)采用原代培養(yǎng)GBM細(xì)胞從標(biāo)本中分離、培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stemcells,GSCs)并移植到裸鼠腦內(nèi),應(yīng)用Cdk2/Cdc2抑制劑治療后觀察GSCs的遷移距離;應(yīng)用直接表達(dá)miR-26a的細(xì)胞株植入裸鼠腦內(nèi),觀察其侵襲能力。
2)構(gòu)建并克隆KAP高表達(dá)質(zhì)粒,shKAP,miR-26表達(dá)質(zhì)粒及相應(yīng)對(duì)照質(zhì)粒,應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并包裝成具有感染能力的慢病毒,應(yīng)用濃縮后的病毒上清感染GBM細(xì)胞系U87、
10、U251和LN229,應(yīng)用壓力選擇制備穩(wěn)定表達(dá)上述基因或miRNA的細(xì)胞系。
3)采用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對(duì)處理的細(xì)胞進(jìn)行染色鑒定KAP和ROCK1/2在胞內(nèi)的表達(dá)部位;鑒定細(xì)胞侵襲有關(guān)的絲狀偽足的多少。
4)應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)不同條件處理的細(xì)胞中KAP,miR-26a的表達(dá)情況。
5)應(yīng)用western Blot檢測(cè) miR-26a下游KAP,ROCK1/2、ROCKβ、Rac1、CDK2、
11、CDK4、CDK6、Rb及其不同的磷酸化位點(diǎn),Cde2、pCdc2、CyclinD1、Cadesman等的表達(dá)情況。
6)應(yīng)用Transwell檢測(cè)miR-26a表達(dá)和KAP表達(dá)對(duì)GBM細(xì)胞侵襲能力的影響。
7)構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因KAP mRNA3'UTR和KAP mRNA3'UTR突變位點(diǎn),檢測(cè)miR-26a與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域直接結(jié)合的能力。
8)應(yīng)用Rac1活性試劑盒測(cè)定miR-26
12、a和KAP對(duì)Rac1激活能力的影響。應(yīng)用ROCK2活性測(cè)定試劑盒檢測(cè)ROCK磷酸化活性位點(diǎn)。
結(jié)果:
1) KAP可與ROCK2,ROCK1,ROCKβ直接結(jié)合,KAP蛋白表達(dá)下調(diào)同時(shí)減少與之結(jié)合的ROCK2蛋白可激活下游的Rac1蛋白。
2) KAP蛋白表達(dá)下調(diào)直接激活CDK2蛋白表達(dá)上調(diào)使Rb去磷酸化進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F直接激活Cdc2依賴的GBM細(xì)胞侵襲通路。
3) KAP表達(dá)下調(diào)
13、和ROCK抑制也增加Caldesman磷酸化,證實(shí)KAP調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移活性通過(guò)調(diào)節(jié)Caldesman的活性。
4)應(yīng)用Cdk2和Cdc2的小分子抑制劑purvalanolA阻斷KAP依賴的侵襲途徑,結(jié)果發(fā)現(xiàn)purvalanol A在體外能夠明顯減少GSCs的侵襲能力。
5) miR-26a可通過(guò)與PTEN mRNA3'UTR靶向結(jié)合通過(guò)Akt途徑促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲,在PTEN缺陷的GBM細(xì)胞系U251和U87中可通過(guò)
14、下調(diào)KAP表達(dá),激活Cdc2依賴的GBM通路。
6) miR-26a通過(guò)與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合促進(jìn)GBM的侵襲,KAPmRNA3'UTR種子區(qū)域內(nèi)兩個(gè)堿基改變可消除這種靶向結(jié)合。
結(jié)論:
1) miR-26a直接與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合導(dǎo)致KAP蛋白表達(dá)減少。
2)同時(shí)KAP減少激活兩條不同的途徑,最終導(dǎo)致Cdc2蛋白表達(dá)增加,促進(jìn)GBM細(xì)胞的侵襲能力。
3
15、)一條途徑為KAP降低導(dǎo)致ROCK2減少,ROCK2減少直接激活Rac1依賴的侵襲途徑,進(jìn)而激活Cyclin D1表達(dá)增加;
4)另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2,CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F,E2F激活Cdc2依賴的GBM細(xì)胞侵襲通路。
5) miR-26a通過(guò)KAP/ROCK2/CDK2通路促進(jìn)GBM細(xì)胞侵襲及細(xì)胞周期進(jìn)展,這一途徑是不依賴PTEN的新的miR-26a靶點(diǎn)和新的G
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