KAP調(diào)節(jié)ROCK2和Cdk2在RNA激活的膠質(zhì)母細胞瘤侵襲途徑.pdf

1、研究背景：
　　多形性膠質(zhì)母細胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是成人顱內(nèi)常見原發(fā)惡性腫瘤，由于腫瘤廣泛侵襲周圍正常腦組織，腫瘤全切困難。盡管通過手術(shù)、放療、化療等綜合治療手段，其預后仍然不佳，患者總體中位生存期在14-16個月。對于GBM侵襲的分子機制，國內(nèi)外學者進行了大量的研究。受體酪氨酸激酶信號通路、細胞外基質(zhì)蛋白分子和細胞跨膜蛋白分子起了重要作用。
　　細胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(cyc

2、lin-dependent kinase-associatedphosphatase，KAP)通過Cdc2依賴的侵襲途徑促進GBM的侵襲。KAP是一雙重特異性磷酸酶，通過去磷酸化Cdk2，抑制Cdk2的活性和細胞周期的進展。在乳腺癌、前列腺癌和肝癌中，KAP表達上調(diào)可增加腫瘤形成。假定KAP抑制細胞周期的進展，其上調(diào)增加腫瘤形成的機制難以解釋。來自于肝細胞癌的研究可能解釋這種現(xiàn)象，在肝細胞癌中，雖然KAP mRNA表達增加，但由于異常剪

3、接的KAP mRNA編碼缺乏Cdk2去磷酸化活性的KAP蛋白，導致大量無功能的KAP蛋白生成。在GBM中，KAP mRNA表達增加，但由于剪接異常，實際上產(chǎn)生大量無功能性KAP蛋白。KAP活性降低導致Cdc2表達上調(diào)，同時應(yīng)用Cdc2抑制劑可拮抗GBM細胞的增殖和遷移過程。但是，KAP如何調(diào)節(jié)Cdc2依賴的GBM侵襲途徑，其詳細機制仍然未明。
　　除剪接外，基因表達的后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可影響KAP蛋白的表達。微小RNA(MicroRNA，

4、miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA，長度一般為20-25個核苷酸，其通過與靶基因的mRNA3'UTR互補結(jié)合，影響蛋白的翻譯，因此，在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)基因的表達。MiRNA通過與增殖和侵襲的相關(guān)基因靶向性結(jié)合，調(diào)節(jié)這些蛋白的表達，進而調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此前報道，mir-26a基因在GBM中高表達，其通過與PTEN、RB1、MEKK2等抑癌基因靶向結(jié)合，下調(diào)其表達促進GBM細胞的增殖和侵襲。在肺癌中miR-26a通過與PTEN的

5、3'UTR靶向性結(jié)合促進肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移，這種現(xiàn)象也可能存在GBM細胞系中。但在鼻咽癌和肝細胞癌中，miR-26a可抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，miR-26a對侵襲的作用具有組織特異性，miR-26a對GBM侵襲能力如何調(diào)節(jié)，其在PTEN突變/缺失的GBM中的靶點和作用機制如何，國內(nèi)外文獻未見相關(guān)報道。
　　本文顯示miR-26a直接與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合，在后轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)KAP蛋白表達。同時KAP蛋白表達減少激活兩

6、條不同的途徑，最終導致Cdc2蛋白表達增加，促進GBM細胞的侵襲過程。一條途徑為KAP降低導致ROCK2減少，ROCK2減少直接激活Rac1依賴的侵襲途徑;另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2，CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F直接激活Cdc2依賴的侵襲途徑。因此，miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2途徑促進GBM細胞侵襲，我們發(fā)現(xiàn)驗證miR-26a靶向性結(jié)合的新的基因位點，這一調(diào)節(jié)在PTEN缺

7、失的GBM中發(fā)揮重要作用，同時我們發(fā)現(xiàn)KAP在GBM侵襲中的作用和具體機制。
　　實驗目的：
　　細胞周期依賴性激酶相關(guān)磷酸酶(KAP)通過Cdc2依賴的調(diào)節(jié)GBM細胞侵襲，然而，KAP調(diào)節(jié)Cdc2依賴侵襲通路的詳細機制仍然未明。我們通過KAP免疫共沉淀結(jié)合蛋白質(zhì)譜分析的方法，篩選與KAP密切相關(guān)的Rho激酶家族成員ROCK1，ROCK2，ROCKβ，驗證KAP/ROCK2/Rac1依賴性的GBM侵襲通路。同時阻斷上述通路并

8、不能完全阻斷GBM細胞的侵襲能力。進一步實驗發(fā)現(xiàn)KAP下調(diào)直接激活CDK2表達使Rb去磷酸化進而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F激活Cdc2依賴的侵襲途徑，驗證KAP/CDK2/Cdc2侵襲途徑。同時檢測miR-26a在PTEN突變/缺失的GBM中的作用，通過預測發(fā)現(xiàn)miR-26a能與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域結(jié)合，驗證miR-26a是否在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)直接下調(diào)KAP蛋白表達，通過上述通路激活Cdc2依賴的GBM侵襲途徑。
　　

9、方法：
　　1)采用原代培養(yǎng)GBM細胞從標本中分離、培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細胞(glioma stemcells，GSCs)并移植到裸鼠腦內(nèi)，應(yīng)用Cdk2/Cdc2抑制劑治療后觀察GSCs的遷移距離;應(yīng)用直接表達miR-26a的細胞株植入裸鼠腦內(nèi)，觀察其侵襲能力。
　　2)構(gòu)建并克隆KAP高表達質(zhì)粒，shKAP，miR-26表達質(zhì)粒及相應(yīng)對照質(zhì)粒，應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染并包裝成具有感染能力的慢病毒，應(yīng)用濃縮后的病毒上清感染GBM細胞系U87、

10、U251和LN229，應(yīng)用壓力選擇制備穩(wěn)定表達上述基因或miRNA的細胞系。
　　3)采用免疫細胞化學的方法對處理的細胞進行染色鑒定KAP和ROCK1/2在胞內(nèi)的表達部位;鑒定細胞侵襲有關(guān)的絲狀偽足的多少。
　　4)應(yīng)用Real-time PCR檢測不同條件處理的細胞中KAP，miR-26a的表達情況。
　　5)應(yīng)用western Blot檢測 miR-26a下游KAP，ROCK1/2、ROCKβ、Rac1、CDK2、

11、CDK4、CDK6、Rb及其不同的磷酸化位點，Cde2、pCdc2、CyclinD1、Cadesman等的表達情況。
　　6)應(yīng)用Transwell檢測miR-26a表達和KAP表達對GBM細胞侵襲能力的影響。
　　7)構(gòu)建熒光素酶報告基因KAP mRNA3'UTR和KAP mRNA3'UTR突變位點，檢測miR-26a與KAP mRNA3'UTR種子區(qū)域直接結(jié)合的能力。
　　8)應(yīng)用Rac1活性試劑盒測定miR-26

12、a和KAP對Rac1激活能力的影響。應(yīng)用ROCK2活性測定試劑盒檢測ROCK磷酸化活性位點。
　　結(jié)果：
　　1) KAP可與ROCK2，ROCK1，ROCKβ直接結(jié)合，KAP蛋白表達下調(diào)同時減少與之結(jié)合的ROCK2蛋白可激活下游的Rac1蛋白。
　　2) KAP蛋白表達下調(diào)直接激活CDK2蛋白表達上調(diào)使Rb去磷酸化進而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F直接激活Cdc2依賴的GBM細胞侵襲通路。
　　3) KAP表達下調(diào)

13、和ROCK抑制也增加Caldesman磷酸化，證實KAP調(diào)節(jié)細胞的遷移活性通過調(diào)節(jié)Caldesman的活性。
　　4)應(yīng)用Cdk2和Cdc2的小分子抑制劑purvalanolA阻斷KAP依賴的侵襲途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)purvalanol A在體外能夠明顯減少GSCs的侵襲能力。
　　5) miR-26a可通過與PTEN mRNA3'UTR靶向結(jié)合通過Akt途徑促進GBM細胞侵襲，在PTEN缺陷的GBM細胞系U251和U87中可通過

14、下調(diào)KAP表達，激活Cdc2依賴的GBM通路。
　　6) miR-26a通過與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合促進GBM的侵襲，KAPmRNA3'UTR種子區(qū)域內(nèi)兩個堿基改變可消除這種靶向結(jié)合。
　　結(jié)論：
　　1) miR-26a直接與KAP mRNA3'UTR靶向性結(jié)合導致KAP蛋白表達減少。
　　2)同時KAP減少激活兩條不同的途徑，最終導致Cdc2蛋白表達增加，促進GBM細胞的侵襲能力。
　　3

15、)一條途徑為KAP降低導致ROCK2減少，ROCK2減少直接激活Rac1依賴的侵襲途徑，進而激活Cyclin D1表達增加;
　　4)另一條途徑為KAP降低直接激活CDK2，CDK2去磷酸化Rb使Rb基因失活進而激活轉(zhuǎn)錄因子E2F，E2F激活Cdc2依賴的GBM細胞侵襲通路。
　　5) miR-26a通過KAP/ROCK2/CDK2通路促進GBM細胞侵襲及細胞周期進展，這一途徑是不依賴PTEN的新的miR-26a靶點和新的G