利用微陣列比較基因組雜交技術(shù)分析牙齦卟啉單胞菌臨床株與低毒力標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277基因組差異.pdf

1、目的：
　　本研究利用慢性牙周炎患者口腔中采集的齦下菌斑，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下分離培養(yǎng)牙銀P卜啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)臨床株，并使用微陣列比較基因組雜交（array-based Comparative Genomic Hybridization,array-CGH)技術(shù)分析P.gingivalis臨床株與低毒力標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277在全基因組水平上的遺傳學(xué)差異，分析差異基因與

2、細(xì)菌致病能力之間關(guān)系，定位高度可疑毒力基因。為今后使用基因芯片技術(shù)尋找P.gingivalis致病基因，臨床大范圍篩查感染高毒力克隆株的高危人群，以及牙周炎基因疫苗靶位點(diǎn)選擇提供幫助，最終為疾病的預(yù)防和診治提供指導(dǎo)。
　　方法：
　　1.研究對(duì)象選擇：選擇慢性牙周炎患者45例，排除其他全身系統(tǒng)性疾病，過去六個(gè)月內(nèi)未曾服用抗生素或接受牙周系統(tǒng)性治療者，無吸煙史，排除妊娠期及哺乳期婦女，知情同意。每位志愿者選擇病變最嚴(yán)重部位以及

3、健康或存在輕度齦炎部位納入研究，記錄采樣部位各項(xiàng)牙周指標(biāo)，所有檢查及指標(biāo)觀察均由同一檢查者完成。
　　2.標(biāo)本采集與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定：收集采樣位點(diǎn)齦下菌斑置于轉(zhuǎn)送液中，稀釋后接種于牛腦心浸出液(BrainHeart Infusion,BHI)培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)，經(jīng)分離、次代純化培養(yǎng)、固體增菌后收集菌體待用。使用試劑盒提取DNA，采用P.gingivalis特異性引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，

4、PCR)，記錄出現(xiàn)陽性條帶樣本，經(jīng)測(cè)序比對(duì)進(jìn)一步確認(rèn)。
　　3.微陣列基因芯片：使用前期實(shí)驗(yàn)中自主設(shè)計(jì)構(gòu)建的全基因組規(guī)模的array-CGH芯片平臺(tái)，覆蓋美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI)上公布的12株P(guān).gingivalis菌的基因組序列信息。
　　4.芯片雜交：利用array-CGH技術(shù)對(duì)P.gingivalis臨床分離株與低毒

5、力標(biāo)準(zhǔn)株P(guān).gingivalis ATCC33277基因組進(jìn)行比較雜交。以ATCC33277自身雜交為陰性對(duì)照，以高毒力株P(guān).gingivalis W83與ATCC33277雜交為陽性對(duì)照?；蚪MDNA經(jīng)酶切，熒光標(biāo)記及純化后，1:1混合與芯片上探針競(jìng)爭雜交。
　　5.結(jié)果分析及PCR驗(yàn)證：掃描芯片獲得探針信號(hào)，所得差異基因利用基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Aligment Search Tool，BLAST)進(jìn)行

6、同源比對(duì)，利用PCR反應(yīng)對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　6.差異基因分析：P.gingivalis菌株間進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖，進(jìn)一步分析所得差異基因的功能以及與細(xì)菌毒力強(qiáng)弱之間關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.本研究從45名慢性牙周炎患者的90個(gè)齦下菌斑樣品中成功分離出142個(gè)特征性黑色菌落。
　　2.經(jīng)PCR特異性擴(kuò)增及測(cè)序比對(duì)確認(rèn)，共成功分離出10株P(guān).gingivalis單克隆株，其中9株培養(yǎng)成功。健康

7、及輕度牙齦炎位點(diǎn)僅分離出1株臨床株，其余8株采樣位點(diǎn)均為牙周炎嚴(yán)重病變位點(diǎn)。為豐富基因多樣性，從同一采樣位點(diǎn)分離的臨床株僅挑取一株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此選取6株P(guān).gingivalis臨床株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　3.基因組DNA與基因芯片上探針競(jìng)爭結(jié)合，掃描后獲得熒光信號(hào)，與自身雜交的標(biāo)準(zhǔn)株ATCC33277為均一的黃色信號(hào)，而6株臨床株與ATCC33277雜交呈現(xiàn)強(qiáng)弱不等的紅綠混雜信號(hào)，不同菌株雜交結(jié)果不一，提示P.gingivali

8、s不同菌株基因組DNA存在基因多樣性和異質(zhì)性。
　　4.臨床株與高毒力株同源性較高，輕度齦炎位點(diǎn)與牙周炎重度病變位點(diǎn)分離的P. gingivalis菌株無顯著基因差異。
　　5.利用array-CGH技術(shù)比較臨床株與低毒力株ATCC33277全基因組DNA，發(fā)現(xiàn)多處基因拷貝數(shù)差異，其中包括一段長度約34.5kb的連續(xù)差異片段PGN—0060到PGN—0095，為ATCC33277特有的轉(zhuǎn)座接合子CTnPg1-a中的一部分，與

9、細(xì)菌基因水平轉(zhuǎn)移功能密切相關(guān)。另外，4株以上臨床株拷貝數(shù)增加的102個(gè)基因均為高毒力株W83與TDC60基因組特有，其中包括兩個(gè)連續(xù)基因片段PG1473到PG1490和PGTDC60—RS04345到PGTDC60—RS04405，長度分別是15.7kb和17.4kb，所包含的基因大部分與細(xì)菌轉(zhuǎn)座結(jié)合功能相關(guān)。兩個(gè)片段的結(jié)構(gòu)及組成與致病島（Pathogenicity Islands，PAIs)特征吻合，可能為P. gingivalis毒