母嬰分離應激致腸易激綜合征的生物學特征及同型半胱氨酸損傷機制.pdf

1、腸易激綜合征(IBS)是一種以腹痛/腹部不適伴排便習慣改變?yōu)樘卣鞯某Ｒ姷墓δ苄阅c病，其發(fā)作具有持續(xù)或反復的特點，缺乏形態(tài)學和生物化學改變的生物學標志，腸道運動紊亂和內(nèi)臟感覺過敏被認為是其重要的病理生理改變。其發(fā)病率高，且發(fā)病以中青年為主，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。該病病因和發(fā)病機制復雜，流行病學調(diào)查顯示，80％ IBS患者中，應激可造成IBS癥狀發(fā)作或加重，有精神創(chuàng)傷史者IBS發(fā)病率明顯高于健康人群，而長期的精神心理應激刺激將對IBS產(chǎn)生

2、直接致病作用。本研究探討應激誘導IBS發(fā)生發(fā)展的生物學基礎(chǔ)及其損傷機制，為深刻認識IBS的病理生理機制、探索其臨床診斷與有效防治措施提供靶點和科學依據(jù)。
　　一、母嬰分離應激致腸易激綜合征的生物學特點
　　新生期母嬰分離(MS)是一種早期負性生活應激事件，可誘導出大鼠IBS主要病理特征即內(nèi)臟痛覺過敏和應激時結(jié)腸運動加強。本研究選用SD新生大鼠，采用新生期母嬰分離方法建立應激致腸易激綜合征大鼠模型，母嬰分離時間為PND（出生后

3、天數(shù)）2-PND21，每天分離3h。按照功能性疾病診斷方法，以大鼠行為學（曠場試驗和蔗糖水偏嗜度試驗反映動物精神活動）、大便性狀及排泄率（單位時間內(nèi)的動物排便粒數(shù)反映其胃腸道轉(zhuǎn)運功能）、結(jié)腸組織病理學和內(nèi)臟敏感性（結(jié)直腸擴張—腹部回撤反應壓力閾值反映動物內(nèi)臟敏感性）等疾病診斷標準確認腸易激綜合征疾病動物模型的建立。
　　結(jié)果顯示，與對照組相比，模型大鼠內(nèi)臟疼痛壓力閾值顯著下降，內(nèi)臟敏感性增強，急性應激后腸道轉(zhuǎn)運加快;出現(xiàn)糖水消耗量

4、下降、探究行為減少及排便數(shù)量顯著增加等抑郁、焦慮樣行為學改變;H-E染色可見結(jié)腸各段組織結(jié)構(gòu)完整，未見病理學改變;大鼠未見生長遲滯，新生期及成年后體重增長未見異常，符合IBS臨床表型特征，表明新生期母嬰分離應激3h致IBS大鼠模型成功建立。對IBS大鼠生物學特點研究結(jié)果表明，新生期母嬰分離應激致大鼠IBS樣癥狀存在性別差異，表現(xiàn)為雌鼠較雄鼠腸道敏感性增高更明顯，這與臨床女性發(fā)病率高于男性相似;分離3h和分離4.5 h的不同應激時間對IB

5、S大鼠癥狀嚴重程度未造成明顯影響;單純分離和分離附加孤養(yǎng)的不同應激類型對IBS大鼠癥狀嚴重程度亦未造成明顯影響。
　　母嬰分離應激致腸易激綜合征的生物學基礎(chǔ)的探索
　　本研究選取母嬰分離應激3h建立IBS大鼠模型，鑒于雌性動物涉及較多的變量因素且多不可控如激素周期的影響，選取雄性大鼠開展下列研究:
　　1.母嬰分離應激致腸易激綜合征的神經(jīng)內(nèi)分泌基礎(chǔ)
　　采用ELISA方法分別檢測大鼠血漿GC、NE、Ach、5-H

6、T、CGRP、SP和GAS濃度。結(jié)果顯示，母嬰分離應激致IBS發(fā)病過程中引起HPA軸和自主神經(jīng)系統(tǒng)異常活化，模型大鼠血漿CORT和Ach濃度較對照組顯著升高;血漿SP、GAS和5-HT水平輕度升高，CGRP濃度顯著升高。急性束縛應激2h后，上述指標均呈現(xiàn)持續(xù)而顯著升高。提示神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂可能是應激致IBS的生物學基礎(chǔ)。母嬰分離大鼠成年后上述神經(jīng)內(nèi)分泌激素持續(xù)高水平，表明早期生活事件引起神經(jīng)內(nèi)分泌長期異常，導致對應激反應的易感性。

7、　　2.母嬰分離應激致腸易激綜合征的炎癥機制
　　采用ELISA方法分別檢測大鼠血漿炎性因子TNF-α和NO水平，可見模型大鼠血漿TNF-α水平較對照組顯著升高，急性束縛應激后進一步增加，且與對照應激組有顯著差異;而血漿NO含量明顯降低，急性應激后進一步下降;甲苯胺藍病理染色觀察可見結(jié)腸肥大細胞活化，結(jié)腸黏膜肥大細胞數(shù)目和脫顆粒比例較對照組增加，表明母嬰分離應激致IBS發(fā)病過程中存在炎癥反應。
　　3.母嬰分離應激致腸易激綜

8、合征的代謝機制
　　采用代謝組學技術(shù)分析母嬰分離應激致IBS大鼠血清內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，定性分析發(fā)現(xiàn)早期應激造成機體氨基酸、糖類及脂類共45種代謝產(chǎn)物發(fā)生異常改變，其中7種代謝分子包括絲氨酸、甘氨酸及纈氨酸等在母嬰分離組明顯增高，上述氨基酸參與腸道內(nèi)多種生物活性物質(zhì)的合成與調(diào)節(jié)，對維持腸黏膜完整性和腸道功能意義重大，表明母嬰分離應激致IBS發(fā)病過程中機體形成腸易激綜合征易感的代謝模式。
　　采用HPLC方法檢測血漿中Hcy水平，

9、發(fā)現(xiàn)模型大鼠血漿Hcy水平顯著升高，急性應激后進一步升高，出現(xiàn)Hcy代謝異常，但早期應激與成年后急性應激的疊加效應不明顯。代謝組學結(jié)果顯示，模型大鼠血漿絲氨酸含量顯著升高，絲氨酸是Hcy轉(zhuǎn)硫代謝的關(guān)鍵底物，Western blot顯示結(jié)腸組織Hcy轉(zhuǎn)硫代謝酶胱硫醚β-合成酶(CBS)表達水平下降，表明在母嬰分離應激致IBS進程中Hcy轉(zhuǎn)硫代謝受到抑制，導致Hcy代謝異常。
　　應激所致氨基酸等代謝模式異?？赡苁悄笅敕蛛x應激致IBS

10、發(fā)病的分子基礎(chǔ)。Hcy作為前炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)分子，其代謝異?？赡軉踊蚪閷Я四笅敕蛛x應激所致IBS的病理過程。
　　三、 Hcy在母嬰分離應激致腸易激綜合征發(fā)病中的損傷機制
　　1.Hcy是母嬰分離應激致IBS發(fā)生的重要介導因子
　　為了觀察Hcy在母嬰分離應激致IBS發(fā)生中的作用，本實驗采用外源性補充Hcy代謝輔酶復合物（葉酸、維生素B6、維生素B12和甜菜堿復合水溶液）調(diào)節(jié)機體Hcy水平，將IBS模型大鼠隨機分為

11、兩組，一組給予Hcy代謝輔酶(MS+ VitB)，一組給予水(MS)，灌胃體積2 ml，連續(xù)7天;對照組為不接受分離應激大鼠，給予水灌胃。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，補充Hcy代謝輔酶組大鼠血漿Hcy水平較模型大鼠顯著降低，下降了30％，但仍略高于對照組Hcy水平。伴隨血漿Hcy水平的降低， IBS大鼠腸道內(nèi)臟高敏和轉(zhuǎn)運增強癥狀明顯改善，同時血漿炎性因子TNF-α水平隨之降低，進一步確認Hcy介導了母嬰分離應激致IBS的發(fā)生。
　　2.Hcy對母嬰

12、分離應激致IBS大鼠腸道屏障功能的調(diào)控
　　為了探討Hcy介導母嬰分離應激致IBS的生物學機制，首先，通過三糖試驗觀察Hcy對腸道通透性的影響。采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)測定尿液中不同時間段內(nèi)甘露醇、乳果糖和三氯蔗糖三種糖分子探針含量，發(fā)現(xiàn)灌服三糖分子水溶液后0-5 h，各組大鼠尿液中甘露醇排泄量未見差別，模型大鼠乳果糖排泄量較對照組顯著增加，乳果糖/甘露醇比值顯著增高，補充Hcy代謝輔酶后明顯下降;6-2

13、4 h模型大鼠尿液中三氯蔗糖排泄量亦較對照組顯著增加，給予維生素后明顯降低，表明母嬰分離應激致IBS進程中腸道細胞旁通透性增高，腸道上皮機械屏障功能受損，調(diào)節(jié)Hcy水平后此損傷效應明顯減輕。
　　采用透射電鏡觀察Hcy對結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)完整性的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，與對照組相比，緊密連接疏松、間隙增寬、密度降低，調(diào)節(jié)Hcy水平后，結(jié)腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性得以恢復。
　　采用Western b

14、lot和免疫熒光方法觀察Hcy對結(jié)腸上皮緊密連接蛋白occludin表達及分布的影響，發(fā)現(xiàn)模型大鼠結(jié)腸上皮緊密連接蛋白occludin表達水平較對照組顯著減少，補充Hcy代謝輔酶后表達量的降低有所減緩;模型大鼠結(jié)腸黏膜上皮occludin分布發(fā)生改變，陽性染色變淡，分布不連續(xù)，調(diào)節(jié)Hcy水平后上述改變有所緩解，提示母嬰分離應激致IBS進程中，結(jié)腸緊密連接受到破壞，導致結(jié)腸旁細胞通透性增加，出現(xiàn)上皮屏障功能障礙，調(diào)控Hcy水平對母嬰分離應

15、激誘導的IBS模型大鼠腸黏膜屏障損傷具有一定的修復作用。表明Hcy可能是通過損傷腸道緊密連接屏障進而介導了IBS的病理過程，而occludin可能是Hcy介導IBS的分子基礎(chǔ)。
　　3.Hcy破壞緊密連接蛋白的作用機制
　　為了進一步研究Hcy對腸黏膜機械屏障功能的損傷機制，本實驗采用Caco-2細胞建立體外結(jié)腸上皮細胞緊密連接模型，給予低濃度Hcy（不造成細胞凋亡的濃度）與TNF-α單獨或聯(lián)合干預24 h，采用Wester

16、n blot和細胞免疫熒光技術(shù)觀察緊密連接蛋白occludin表達和分布變化，結(jié)果顯示，Hcy干預引起occludin表達減少，occludin蛋白由細胞膜頂端向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)分布異常。提示Hcy可直接破壞細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，引起細胞旁通路開放，造成腸道通透性增高，從而誘發(fā)炎癥反應。即Hcy單獨啟動了腸道上皮緊密連接的破壞，而不需要TNF-α的介導作用。
　　綜上所述，新生期母嬰分離3h應激可導致IBS發(fā)生，發(fā)病特點具有

17、性別差異，表現(xiàn)為與雄性大鼠相比，雌性大鼠對應激更易感。應激所致神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫炎癥及代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)紊亂造成腸道黏膜損傷和防御機制失衡，腸道屏障功能下降，是母嬰分離應激致IBS易感的病理生理基礎(chǔ)。Hcy代謝異常是母嬰分離應激致IBS的重要介導因子，其可通過改變腸道上皮細胞緊密連接蛋白occludin水平和分布，引起腸道上皮細胞旁通透性增高，腸道上皮機械屏障功能受損，誘導炎癥反應，使腸道處于低度炎性環(huán)境，造成腸道感覺和運動功能異常，從而導致