靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡聯(lián)合UTMD對人肝癌細胞MHCC-H的體外、體內(nèi)增殖抑制作用及凋亡機制研究.pdf

1、（一）靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡的制備及性質(zhì)測定
　　目的：制備靶向載多西紫杉醇微泡，連接腫瘤血管內(nèi)皮細胞特異性的CD105單克隆抗體。
　　方法：本研究采用改良薄膜水化、機械振蕩法制備載多西杉醇脂質(zhì)超聲微泡（DocetaxelLoaded Lipid Microbubble，DLLM）。通過生物素-鏈親和素連接載藥脂質(zhì)體微泡（DLLM）以及CD105單克隆抗體，得到靶向載多西紫杉醇微泡（CD105-DLLM）。隨后進行了以下

2、性質(zhì)測定：
　　1.靶向載多西紫杉醇微泡特征和性質(zhì)測定：凍干機凍干后，掃描電鏡（SEM）下觀察；采用粒度分析儀測量微泡粒徑，將微泡按一定比例稀釋，水浴超聲分散30min，測量微泡粒徑；
　　2.CD105-DLLM包封率和載藥量測定：使用反相高效液相色譜（HPLC）法檢測包封率、載藥量；
　　3.CD105-DLLM的體外釋藥測定：通過制備模擬體液，將CD105-DLLM裝入透析袋，分為UTMD（UltrasoundT

3、argeted Microbubble Destruction，超聲靶向微泡破壞技術(shù)）組、自然釋放組，進行體外釋藥測定，濃度由HPLC法測得；
　　4.CD105-DLLM穩(wěn)定性初步考察：將新鮮制備的CD105-DLLM凍干后，分別保存在冷藏（2-8℃）或常溫環(huán)境下，之后每日取少量微泡，并觀察微泡并照片，同時檢測包封率和載藥量。
　　結(jié)果：
　　1.一般形態(tài)觀察：掃描電鏡（SEM）下，CD105-DLLM形態(tài)規(guī)則，外形

4、圓整，分散好，未見明顯粘連，粒徑分布均勻。平均粒徑：3220±1570 nm。
　　2.HPLC法測定CD105-DLLM包封率及載藥量：測得包封率為80-86.5％，載藥量18.5-23%。
　　3.穩(wěn)定性實驗結(jié)果：4℃下存放微泡為適宜溫度，微泡宜新鮮制備。
　　4.HPLC法測得在48h內(nèi)，CD105-DLLM+UTMD組在超聲爆破后得以完全釋放，藥物釋放率達到100%，達到快速釋放的目的。
　　結(jié)論：本部分

5、實驗制備了一種靶向微泡-將多西紫杉醇包封于脂質(zhì)體中并連接CD105抗體，制備了穩(wěn)定性較好，包封率、載藥量均較高的CD105-DLLM，還能在UTMD介導(dǎo)下能夠達到快速釋放的目的。
　?。ǘ︰TMD介導(dǎo)下靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)體微泡（CD105-DLLM）對人肝癌細胞MHCC-H的增殖抑制作用及靶向能力測定
　　目的：通過體外細胞及荷瘤動物體內(nèi)實驗，探討由CD105單克隆抗體標記的載多西紫杉醇脂質(zhì)體微泡（CD105-DLLM+

6、UTMD）對人肝癌細胞MHCC-H的靶向能力；通過離體（細胞）及在體（動物）實驗，明確 CD105-DLLM+UTMD對人肝癌細胞MHCC-H的增殖抑制效果。
　　方法：體外培育MHCC-H肝癌細胞系。細胞培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2、飽和濕度，含10%胎牛血清的DMEM-HG培養(yǎng)，隔日換液，90%融合時傳代。待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定時進行實驗，分為四組：Control，DOC，DLLM，CD105-DLLM+UTMD。對不同組別細胞分

7、別進行以下測定：
　　1.CD105-DLLM體外尋靶實驗：分別使用Cy3-PEG-Biotin標記CD105-DLLM、DLLM，選取處于對數(shù)生長期的MHCC-H細胞，置于6孔板中爬片生長后染色后，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）下觀察微泡對肝癌細胞的體外靶向能力，用IPP7.0分析軟件進行數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計。
　　2.體外細胞活力、增殖抑制實驗。用CCK-8法檢測四組不同方式對人肝癌細胞MHCC-H增殖抑制作用，具體包括：

8、　　①通過CCK-8法測定不同處理方式對人肝癌細胞MHCC-H細胞活力的影響；
　?、谕ㄟ^CCK-8法測定不同處理方式對人肝癌細胞MHCC-H增殖的作用。
　　3.荷瘤裸鼠體內(nèi)CD105-DLLM尋靶實驗：采用快速種植法建立荷瘤裸鼠模型。
　?、俳３晒螅謩e向裸鼠尾靜脈注入Cy-3標記CD105-DLLM后給予UTMD和Cy3標記的DLLM；將麻醉好的荷瘤裸鼠置于小動物活體成像系統(tǒng)實驗臺內(nèi)，檢測Cy-3染料標記CD

9、105-DLLM在荷瘤裸鼠體內(nèi)發(fā)光情況；
　?、谟^察不同處理方式對荷瘤裸鼠生存時間的影響，繪制生存曲線圖；
　　③檢測、觀察不同組別中荷瘤裸鼠腫瘤生長的影響，并用超聲二維成像、小動物活體成像系統(tǒng)對裸鼠體內(nèi)CD105-DLLM聯(lián)合UTMD后的情況進行圖像采集、分析。
　　結(jié)果：
　　1.體外細胞活力結(jié)果顯示：CD105-DLLM+UTMD組在4h后其細胞活力的抑制作用顯著強于其它各組（P<0.01）；
　　2

10、.細胞增殖抑制實驗結(jié)果表明：CD105-DLLM+UTMD組在各時間點內(nèi)對人肝癌細胞MHCC-H的增殖抑制作用均明顯高于其它各組（P<0.01）。
　　3.通過免疫熒光實驗觀察到CD105–DLLM在體外具備良好的靶向性。
　　4.荷瘤裸鼠體內(nèi)實驗：
　?、貶E染色結(jié)果示成功建立MHCC-H荷瘤裸鼠模型；
　?、隗w內(nèi)動物尋靶能力測定結(jié)果：小動物活體熒光成像發(fā)現(xiàn)，CD105-DLLM組可檢測到紅色熒光聚集于腫瘤部位

11、，而Control組無法檢測到區(qū)別于背景的紅色熒光區(qū)域，證實了CD105-DLLM在荷瘤裸鼠體內(nèi)也具有良好的靶向性；
　?、蹖Ω鹘M的荷瘤裸鼠進行了生存曲線對比。結(jié)果顯示，CD105-DLLM+UTMD組裸鼠較 Control組相比，生存時間明顯延長。
　?、艹暥S圖示CD105-DLLM+UTMD組裸鼠腫瘤體積相對Control組，腫瘤體積明顯減小。
　　結(jié)論：
　　1.CD105-DLLM+UTMD能夠降低人

12、肝癌細胞 MHCC-H細胞活力；
　　2.CD105-DLLM+UTMD對MHCC-H細胞具有增殖抑制作用；
　　3.CD105-DLLM在體外（細胞）、體內(nèi)（荷瘤裸鼠）均具備靶向能力。
　?。ㄈ︰TMD介導(dǎo)下CD105-DLLM對人肝癌細胞 MHCC-H增殖抑制、凋亡的作用機制
　　目的：探討UTMD下的CD105-DLLM對于人肝癌細胞MHCC-H的作用，研究其細胞周期、細胞凋亡、凋亡相關(guān)蛋白的影響，探索凋

13、亡相關(guān)機制。
　　方法：將對數(shù)生長期 MHCC-H細胞分為四組：空白微泡（CON），單純多西紫杉醇（DOC），載多西紫杉醇微泡（DLLM），靶向載多西紫杉醇脂質(zhì)微泡并以超聲爆破（ CD105-DLLM+UTMD）組：
　　1.用流式細胞儀檢測細胞周期、凋亡周期；
　　2.用TUNEL檢測各組MHCC-H細胞的凋亡，用IPP7.0軟件選取凋亡細胞，計算凋亡細胞百分比；
　　3.Western blotting檢測各

14、組凋亡相關(guān)蛋白Bax，Bcl-2，Cyto-c，P53， Caspase-3表達的變化、蛋白含量；
　　4.激光共聚焦顯微鏡（LSCM）下觀察人肝癌MHCC-H活細胞中Caspase-3含量及細胞形態(tài)變化。
　　結(jié)果
　?。?.流式細胞儀檢測結(jié)果顯示：CD105-DLLM+UTMD顯著抑制分裂期細胞比例。CD105-DLLM聯(lián)合超聲靶向釋藥顯著抑制肝癌細胞MHCC-H分裂期細胞比例，能在抑制肝癌細胞增殖的同時顯著增加M

15、HCC-H細胞凋亡率；
　　2.TUNEL原位凋亡檢測顯示CD105-DLLM誘導(dǎo)人肝癌細胞 MHCC-H凋亡；
　　3.CD105-DLLM+UTMD組中，Cyt-c、Bax/Bcl-2、P53的表達均顯著高于其他各組（P均<0.01），而在Caspase3的激活實驗中，發(fā)現(xiàn)DOC組及CD105-DLLM+UTMD組均可引起Caspase3的大量激活，以CD105-DLLM+UTMD引起的Caspase-3數(shù)量更為顯著。<

16、br>　　4.通過 LSCM觀察活細胞Caspase-3的含量，在5h內(nèi)細胞核中可見Caspase3激活產(chǎn)生的綠色團塊（凋亡細胞）出現(xiàn)并逐漸增多，而細胞質(zhì)及細胞形態(tài)無變化；5h后細胞核內(nèi)綠色團塊繼續(xù)增加、細胞質(zhì)內(nèi)逐步出現(xiàn)綠色凋亡小體；在作用10h后，CD105-DLLM+UTMD組出現(xiàn)了明顯的Caspase-3移位，多數(shù)激活的Caspase-3轉(zhuǎn)移至細胞膜表面。
　　結(jié)論：在該試驗條件下，UTMD介導(dǎo)的CD105-DLLM可通過抑

17、制增值期細胞比例來抑制肝癌細胞增殖，同時激活了凋亡同路并誘導(dǎo)人肝癌細胞MHCC-H發(fā)生凋亡、引起了Caspase-3激活及移位，從而發(fā)揮其腫瘤抑制作用。
　　小結(jié)：本實驗將多西紫杉醇包封于脂質(zhì)體中并連接CD105抗體，制備了穩(wěn)定性較好，包封率、載藥量均較高，在UTMD介導(dǎo)下能夠快速釋放的靶向載藥脂質(zhì)超聲微泡。通過對各組人肝癌細胞 MHCC-H的細胞活力、細胞增殖水平的測定發(fā)現(xiàn)：CD105-DLLM+UTMD能夠明顯降低MHCC-H