多烯紫杉醇在體內(nèi)外對(duì)人肝細(xì)胞肝癌抑制生長(zhǎng)及放射增敏實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分,多烯紫杉醇抑制人肝細(xì)胞肝癌(HCC)生長(zhǎng)及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡.目的:在體內(nèi)外探討多烯紫杉醇(docetaxel)對(duì)人HCC生長(zhǎng)抑制的影響,并初步探索多烯紫杉醇誘導(dǎo)肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡及其機(jī)理.方法:用不同濃度的多烯紫杉醇處理SMMC-7721細(xì)胞,用集落形成試驗(yàn)檢測(cè)多烯紫杉醇對(duì)SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定多烯紫杉醇對(duì)SMMC-7721細(xì)胞株細(xì)胞周期及凋亡的影響、丫啶橙/溴化乙啶(acridine

2、orange/ethidium bromide,AO/EB)雙染熒光顯微鏡和透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡及用藥后細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的變化.用裸鼠制作人HCC模型觀察多烯紫杉醇在體內(nèi)對(duì)人肝癌生長(zhǎng)抑制影響,以腫瘤生長(zhǎng)延遲(absolute growth delay,AGD)時(shí)間即單純用藥組腫瘤從平均0.8cm到1.4cm所需要天數(shù)減去空白對(duì)照組達(dá)到

3、同樣大小所需要天數(shù)評(píng)價(jià)多烯紫杉醇的抗腫瘤效應(yīng).第二部分,多烯紫杉醇對(duì)人肝細(xì)胞肝癌(HCC)放療增敏實(shí)驗(yàn)研究.目的:探討多烯紫杉醇在體內(nèi)外對(duì)人體HCC的放射增敏作用及其初步機(jī)制.方法:在體外用0.125nM、0.25nM、0.5nM多烯紫杉醇作用人SMMC-7721 HCC細(xì)胞株24小時(shí)和0.125nM、0.25nM、0.5nM多烯紫杉醇作用48小時(shí)后分別給予0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy劑量照射,單純照射組未給予多烯紫

4、杉醇處理而接受同等照射劑量照射,用集落形成試驗(yàn)分析多烯紫杉醇放射增敏效應(yīng).在體內(nèi)用裸鼠制作人HCC模型,當(dāng)腫瘤生長(zhǎng)至平均0.8cm時(shí)將它們隨機(jī)分組,分別為空白對(duì)照組、多烯紫杉醇單純用藥組、用藥加照射組、單純照射組.用藥加照射組給藥后24、48小時(shí)后分別在室溫下用<'137>Cs源按分割劑量照射局部腫瘤,每次分別給予5Gy,總劑量為10Gy,以校正過(guò)的生長(zhǎng)延遲(NGD,normalized growth delay)時(shí)間即用藥加照射組腫瘤

5、從0.8cm到1.4cm所需要天數(shù)減去單純用藥組達(dá)到同樣大小所需要天數(shù)以及放射增敏因子(EF,enhancement factor)評(píng)價(jià)多烯紫杉醇的放射增敏效應(yīng).另外用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)上述不同濃度多烯紫杉醇分別作用不同時(shí)間SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)和用比色法測(cè)定谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量的變化.第三部分,多烯紫杉醇對(duì)SSMC-7721細(xì)胞bcl-2和p21

6、基因表達(dá)的影響.目的:探討用不同濃度多烯紫杉醇作用于SSMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間引起凋亡和細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)一步在基因水平研究多烯紫杉醇生長(zhǎng)抑制、誘導(dǎo)凋亡和放射增敏機(jī)制.方法:分別用10nM多烯紫杉醇處理SMMC-7721細(xì)胞6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和用0.5nM多烯紫杉醇處理12小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí),對(duì)照組不給任何藥物處理.實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞總RNA被抽提并被轉(zhuǎn)錄成cDNA.cDNA用Oligdt<,18>引物從3μg

7、 RNA合成.實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)按照Light Cycler-DNA Master SYBER Green 1試劑盒使用說(shuō)明操作.Bcl-2和p21基因用特殊寡核苷酸引物擴(kuò)增,看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)也在同時(shí)用特殊引物擴(kuò)增.所有DNA在Light Cycler基因擴(kuò)增儀上按95℃ 0秒,65℃ 5秒,72℃ 10秒,40℃ 30秒共40個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增.實(shí)時(shí)連續(xù)檢測(cè)基因擴(kuò)增過(guò)程中所致熒光變化,以達(dá)到指數(shù)擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)周期