C225-GNPs對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　制備符合實(shí)驗(yàn)要求具有EGFR靶向性的納米金顆粒，用于體外放射治療研究，研究C225-GNPs聯(lián)合兆伏級(jí)X射線對(duì)EGFR高表達(dá)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的體外放射增敏效應(yīng)，并從細(xì)胞周期改變、細(xì)胞凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑探討C225-GNPs的放射增敏機(jī)制。
　　方法:
　　首先運(yùn)用檸檬酸還原法合成尺徑20nm納米金，運(yùn)用靜電吸附形成Au-S、Au-N合成C225-金納米共軛物。采用透射電鏡、紫外分光光度儀、動(dòng)態(tài)

2、光散射儀以及酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)兩種納米材料進(jìn)行表征;GNPs、C225-GNPs與SMMC-7721細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，電鏡下觀察兩組細(xì)胞對(duì)納米顆粒的攝取，將EGFR高表達(dá)SMMC-7721細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，利用CCK-8法檢測(cè)不同濃度下GNPs、C225-GNPs對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用，繪制細(xì)胞增殖抑制曲線，計(jì)算IC50值。選用1/5IC50濃度的GNPs、C225-GNPs與細(xì)胞共培養(yǎng)24h后進(jìn)行6MVX線照射(照射劑

3、量為:0、0.5、1、2、4、6Gy)，采用平板細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)研究GNPs、C225-GNPs的放射增敏效應(yīng)，利用單擊多靶模型繪制細(xì)胞存活曲線，求出D0、Dq等相關(guān)放射生物學(xué)參數(shù)，計(jì)算放射增敏比(SER)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期改變。蛋白印跡法檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。
　　結(jié)果:
　　透射電鏡顯示實(shí)驗(yàn)合成的C225-GNPs大小均勻，分散性良好。探針表面蛋白經(jīng)磷鎢酸染色，粒子表面可見(jiàn)一層薄薄的白

4、色光圈。偶聯(lián)抗體并使用蛋白封閉多余位點(diǎn)后，顆粒粒徑一定程度增大，提示蛋白包被成功。平均單個(gè)納米金顆粒表面偶聯(lián)94.65個(gè)抗體，C225-GNPs性質(zhì)較穩(wěn)定。電鏡結(jié)果顯示C225-GNPs較GNPs在EGFR高表達(dá)SMMC-7721細(xì)胞中有更多沉積，且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積明顯。利用不同濃度GNPs、C225-GNPs處理細(xì)胞后，C225-GNPs對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用較明顯，IC50分別為6.14μg/ml、4.11μg/ml，通過(guò)平板細(xì)胞克隆形成

5、實(shí)驗(yàn)計(jì)算放射增敏比(D0/D0)分別為1.54、1.66，放射增敏比(Dq/Dq)分別為1.38、1.85。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示C225-GNPs聯(lián)合X射線較GNPs組，細(xì)胞凋亡率明顯增加;C225-GNPs聯(lián)合X射線與GNPs組相比，G2/M期細(xì)胞比例增加(P＜0.05)。蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果提示C225-GNPs組較空白對(duì)照組，C225-GNPs聯(lián)合X射線組較單純照射組，細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)下降，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均有