抑制DDR2策略在異位骨化和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠動(dòng)物模型中的應(yīng)用.pdf

1、盤(pán)狀結(jié)構(gòu)受體2（DDR2）是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，DDR2調(diào)控的相關(guān)信號(hào)在機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育以及腫瘤、纖維化、動(dòng)脈粥樣硬化、骨性關(guān)節(jié)炎（OA）和類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）等許多疾病的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，因此DDR2成為了治療相關(guān)疾病潛在的靶分子。在本實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用抑制DDR2的策略，分別研究GD856和達(dá)沙替尼兩種DDR2小分子抑制劑對(duì)異位骨化和膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠動(dòng)物模型的影響。
　　實(shí)驗(yàn)一 DDR2缺失對(duì)小鼠骨形成的影響

2、　　DDR2可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和分化、成骨細(xì)胞的分化，并能夠抑制破骨細(xì)胞的分化，它在骨形成的作用中發(fā)揮重要作用。雖然在細(xì)胞層面對(duì) DDR2的骨形成作用有較為廣泛的探索，但是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中仍缺乏對(duì) DDR2骨形成作用較為系統(tǒng)的研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較 DDR2缺失小鼠和野生型小鼠的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育以及骨折后、異位骨化后的骨形成情況，研究DDR2在體內(nèi)對(duì)骨形成的作用。
　　結(jié)果顯示：DDR2缺失小鼠骨骼發(fā)育顯著異常，機(jī)體以及骨骼長(zhǎng)度顯著小于

3、野生型小鼠，通過(guò) microCT重建股骨中部皮質(zhì)和股骨遠(yuǎn)端骨小梁后可以發(fā)現(xiàn)，DDR2缺失小鼠骨皮質(zhì)的厚度和骨小梁的相關(guān)骨形成參數(shù)顯著低于野生型小鼠，同時(shí)股骨的三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)表明 DDR2缺失小鼠股骨所能承受的最大力和股骨剛度顯著小于野生型小鼠，雙鈣黃綠素?zé)晒鈱?shí)驗(yàn)顯示DDR2缺失小鼠的骨代謝速度顯著低于野生型小鼠。我們通過(guò)手術(shù)建立了小鼠開(kāi)放式骨折模型，骨折后DDR2缺失小鼠的骨痂形成能力顯著降低，骨折愈合能力顯著減弱。我們對(duì)DDR2缺失小鼠

4、和野生型小鼠建立了創(chuàng)傷-燒傷異位骨化模型，建模10周后通過(guò)microCT掃描重建發(fā)現(xiàn)DDR2缺失小鼠的異位骨化能力顯著低于野生型小鼠。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DDR2缺失后小鼠的骨骼生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體的骨代謝、以及骨折和異位骨化后的骨形成能力受到顯著抑制。
　　實(shí)驗(yàn)二：DDR2小分子抑制劑GD856對(duì)小鼠異位骨化的影響
　　GD856是一種新研制的DDR2小分子抑制劑，能夠在較低的濃度下對(duì)膠原誘導(dǎo)的DDR2磷酸化有較顯著的抑

5、制作用。我們通過(guò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞系MC-3T3-E1分化以及建立小鼠異位骨化模型，研究GD856對(duì)小鼠異位骨化的影響。
　　我們將成骨細(xì)胞系分為未加藥的對(duì)照組、10μM的低劑量組和50μM的高劑量組，在向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的同時(shí)加GD856藥物刺激，三周后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色、堿性磷酸酶（ALP）染色和成骨相關(guān)分子的mRNA測(cè)定。結(jié)果表明低劑量組細(xì)胞的茜素紅陽(yáng)性強(qiáng)度略低于對(duì)照組，而高劑量組的陽(yáng)性強(qiáng)度則顯著低于對(duì)照組和低劑量組。低劑量組細(xì)胞的

6、ALP陽(yáng)性強(qiáng)度顯著強(qiáng)于對(duì)照組，而高劑量組的ALP陽(yáng)性強(qiáng)度則顯著低于對(duì)照組和低劑量組。低濃度組和高劑量組OPN、OCN和BMP2 mRNA的表達(dá)均顯著少于對(duì)照組，高劑量組 ALP的mRNA表達(dá)顯著低于對(duì)照組，而低濃度組ALP和Col I A1以及高劑量組RUNX2在mRNA水平的表達(dá)則顯著高于對(duì)照組。為了在體內(nèi)驗(yàn)證GD856對(duì)小鼠異位骨化的影響，我們建立了創(chuàng)傷-燒傷異位骨化模型，小鼠分為對(duì)照組和給藥組，將給藥組小鼠的飲水為濃度為0.08

7、mg/ml的GD856水溶液。建模10周后我們發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠的骨代謝速度顯著減慢，根骨的異位骨化嚴(yán)重程度顯著減輕。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GD856可以抑制成骨細(xì)胞的分化，并能夠減緩體內(nèi)的骨代謝速度，抑制異位骨化的發(fā)生。
　　實(shí)驗(yàn)三：DDR2小分子抑制劑達(dá)沙替尼對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的影響
　　達(dá)沙替尼是一種第二代酪氨酸激酶抑制劑，對(duì) DDR2活性有較好的抑制作用。達(dá)沙替尼能夠抑制 RA發(fā)病過(guò)程中的多個(gè)關(guān)鍵基因，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建

8、立膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠模型，研究達(dá)沙替尼對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）小鼠的治療作用。
　　我們通過(guò)異種膠原二次免疫的方法建立小鼠的關(guān)節(jié)炎模型，在建模成功后將小鼠分為給藥組和對(duì)照組分別給予達(dá)沙替尼和安慰劑灌胃。結(jié)果表明給藥組小鼠的體重顯著大于對(duì)照組，同時(shí)給藥組小鼠四爪的腫脹程度以及關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度都顯著低于對(duì)照組。通過(guò) microCT對(duì)小鼠的關(guān)節(jié)周?chē)墙M織掃面重建我們發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠關(guān)節(jié)周?chē)约肮切×旱墓琴|(zhì)破壞程度顯著輕于對(duì)照組。小鼠

9、踝關(guān)節(jié)周?chē)M織的組織學(xué)染色結(jié)果顯示給藥組小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)的滑膜細(xì)胞以及炎性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞以及血管翳的形成被顯著抑制。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明達(dá)沙替尼可以減輕CIA發(fā)病的嚴(yán)重程度，緩解CIA的關(guān)節(jié)破壞程度，對(duì)小鼠膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型有較好的治療作用。
　　實(shí)驗(yàn)四：DDR2小分子抑制劑達(dá)沙替尼對(duì)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞的作用
　　成纖維樣滑膜細(xì)胞（FLS）在RA的發(fā)病過(guò)程中對(duì)關(guān)節(jié)的破壞起重要作用，也是治療RA的一

10、個(gè)重要靶細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原代培養(yǎng)RA患者的關(guān)節(jié)FLS，研究達(dá)沙替尼對(duì)RA FLS的作用，探索達(dá)沙替尼治療RA的可能機(jī)制。
　　我們通過(guò)BRDU免疫熒光染色研究達(dá)沙替尼對(duì)RA FLS增殖能力的影響，結(jié)果表明經(jīng)達(dá)沙替尼刺激24小時(shí)后的FLS的BRDU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，這表明FLS的增殖能力顯著受到抑制。通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)判斷FLS遷移能力的改變，結(jié)果表明達(dá)沙替尼刺激24小時(shí)后FLS的遷移能力被顯著抑制

11、。用流失細(xì)胞儀檢測(cè)FLS的凋亡能力我們發(fā)現(xiàn)在達(dá)沙替尼刺激的第3天和第5天凋亡的細(xì)胞數(shù)量顯著增多。運(yùn)用RT-PCR我們發(fā)現(xiàn)達(dá)沙替尼刺激24小時(shí)后，F(xiàn)LS中VEGF、FGF、MMP13和DKK1在mRNA水平的表達(dá)顯著降低。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，達(dá)沙替尼可以抑制RA FLS的增殖和遷移，同時(shí)能夠誘導(dǎo)FLS的凋亡，且可以在mRNA水平抑制VEGF、FGF、MMP13和DKK1的表達(dá)。這可能是達(dá)沙替尼治療Ra的重要機(jī)制，表明FLS可能是達(dá)