抑制DDR2策略在異位骨化和類風濕性關節(jié)炎小鼠動物模型中的應用.pdf

1、盤狀結構受體2（DDR2）是一種受體型蛋白酪氨酸激酶，DDR2調(diào)控的相關信號在機體的生長發(fā)育以及腫瘤、纖維化、動脈粥樣硬化、骨性關節(jié)炎（OA）和類風濕性關節(jié)炎（RA）等許多疾病的發(fā)病過程中起重要作用，因此DDR2成為了治療相關疾病潛在的靶分子。在本實驗中，我們運用抑制DDR2的策略，分別研究GD856和達沙替尼兩種DDR2小分子抑制劑對異位骨化和膠原誘導關節(jié)炎小鼠動物模型的影響。
　　實驗一 DDR2缺失對小鼠骨形成的影響

2、　　DDR2可以促進軟骨細胞的增殖和分化、成骨細胞的分化，并能夠抑制破骨細胞的分化，它在骨形成的作用中發(fā)揮重要作用。雖然在細胞層面對 DDR2的骨形成作用有較為廣泛的探索，但是在體內(nèi)實驗中仍缺乏對 DDR2骨形成作用較為系統(tǒng)的研究。本實驗通過比較 DDR2缺失小鼠和野生型小鼠的骨骼生長發(fā)育以及骨折后、異位骨化后的骨形成情況，研究DDR2在體內(nèi)對骨形成的作用。
　　結果顯示：DDR2缺失小鼠骨骼發(fā)育顯著異常，機體以及骨骼長度顯著小于

3、野生型小鼠，通過 microCT重建股骨中部皮質和股骨遠端骨小梁后可以發(fā)現(xiàn)，DDR2缺失小鼠骨皮質的厚度和骨小梁的相關骨形成參數(shù)顯著低于野生型小鼠，同時股骨的三點彎曲實驗表明 DDR2缺失小鼠股骨所能承受的最大力和股骨剛度顯著小于野生型小鼠，雙鈣黃綠素熒光實驗顯示DDR2缺失小鼠的骨代謝速度顯著低于野生型小鼠。我們通過手術建立了小鼠開放式骨折模型，骨折后DDR2缺失小鼠的骨痂形成能力顯著降低，骨折愈合能力顯著減弱。我們對DDR2缺失小鼠

4、和野生型小鼠建立了創(chuàng)傷-燒傷異位骨化模型，建模10周后通過microCT掃描重建發(fā)現(xiàn)DDR2缺失小鼠的異位骨化能力顯著低于野生型小鼠。
　　本實驗結果表明，DDR2缺失后小鼠的骨骼生長發(fā)育、機體的骨代謝、以及骨折和異位骨化后的骨形成能力受到顯著抑制。
　　實驗二：DDR2小分子抑制劑GD856對小鼠異位骨化的影響
　　GD856是一種新研制的DDR2小分子抑制劑，能夠在較低的濃度下對膠原誘導的DDR2磷酸化有較顯著的抑

5、制作用。我們通過誘導成骨細胞系MC-3T3-E1分化以及建立小鼠異位骨化模型，研究GD856對小鼠異位骨化的影響。
　　我們將成骨細胞系分為未加藥的對照組、10μM的低劑量組和50μM的高劑量組，在向成骨細胞誘導的同時加GD856藥物刺激，三周后對細胞進行茜素紅染色、堿性磷酸酶（ALP）染色和成骨相關分子的mRNA測定。結果表明低劑量組細胞的茜素紅陽性強度略低于對照組，而高劑量組的陽性強度則顯著低于對照組和低劑量組。低劑量組細胞的

6、ALP陽性強度顯著強于對照組，而高劑量組的ALP陽性強度則顯著低于對照組和低劑量組。低濃度組和高劑量組OPN、OCN和BMP2 mRNA的表達均顯著少于對照組，高劑量組 ALP的mRNA表達顯著低于對照組，而低濃度組ALP和Col I A1以及高劑量組RUNX2在mRNA水平的表達則顯著高于對照組。為了在體內(nèi)驗證GD856對小鼠異位骨化的影響，我們建立了創(chuàng)傷-燒傷異位骨化模型，小鼠分為對照組和給藥組，將給藥組小鼠的飲水為濃度為0.08

7、mg/ml的GD856水溶液。建模10周后我們發(fā)現(xiàn)給藥組小鼠的骨代謝速度顯著減慢，根骨的異位骨化嚴重程度顯著減輕。
　　本實驗結果表明GD856可以抑制成骨細胞的分化，并能夠減緩體內(nèi)的骨代謝速度，抑制異位骨化的發(fā)生。
　　實驗三：DDR2小分子抑制劑達沙替尼對小鼠膠原誘導關節(jié)炎的影響
　　達沙替尼是一種第二代酪氨酸激酶抑制劑，對 DDR2活性有較好的抑制作用。達沙替尼能夠抑制 RA發(fā)病過程中的多個關鍵基因，本實驗通過建

8、立膠原誘導關節(jié)炎的小鼠模型，研究達沙替尼對膠原誘導關節(jié)炎（CIA）小鼠的治療作用。
　　我們通過異種膠原二次免疫的方法建立小鼠的關節(jié)炎模型，在建模成功后將小鼠分為給藥組和對照組分別給予達沙替尼和安慰劑灌胃。結果表明給藥組小鼠的體重顯著大于對照組，同時給藥組小鼠四爪的腫脹程度以及關節(jié)炎的嚴重程度都顯著低于對照組。通過 microCT對小鼠的關節(jié)周圍骨組織掃面重建我們發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠關節(jié)周圍以及骨小梁的骨質破壞程度顯著輕于對照組。小鼠

9、踝關節(jié)周圍組織的組織學染色結果顯示給藥組小鼠關節(jié)內(nèi)的滑膜細胞以及炎性細胞數(shù)量顯著減少，關節(jié)軟骨和骨質的破壞以及血管翳的形成被顯著抑制。
　　本實驗結果表明達沙替尼可以減輕CIA發(fā)病的嚴重程度，緩解CIA的關節(jié)破壞程度，對小鼠膠原誘導關節(jié)炎模型有較好的治療作用。
　　實驗四：DDR2小分子抑制劑達沙替尼對類風濕性關節(jié)炎滑膜細胞的作用
　　成纖維樣滑膜細胞（FLS）在RA的發(fā)病過程中對關節(jié)的破壞起重要作用，也是治療RA的一

10、個重要靶細胞。本實驗通過原代培養(yǎng)RA患者的關節(jié)FLS，研究達沙替尼對RA FLS的作用，探索達沙替尼治療RA的可能機制。
　　我們通過BRDU免疫熒光染色研究達沙替尼對RA FLS增殖能力的影響，結果表明經(jīng)達沙替尼刺激24小時后的FLS的BRDU陽性細胞數(shù)量顯著減少，這表明FLS的增殖能力顯著受到抑制。通過細胞劃痕實驗和Transwell小室遷移實驗判斷FLS遷移能力的改變，結果表明達沙替尼刺激24小時后FLS的遷移能力被顯著抑制

11、。用流失細胞儀檢測FLS的凋亡能力我們發(fā)現(xiàn)在達沙替尼刺激的第3天和第5天凋亡的細胞數(shù)量顯著增多。運用RT-PCR我們發(fā)現(xiàn)達沙替尼刺激24小時后，F(xiàn)LS中VEGF、FGF、MMP13和DKK1在mRNA水平的表達顯著降低。
　　本實驗結果表明，達沙替尼可以抑制RA FLS的增殖和遷移，同時能夠誘導FLS的凋亡，且可以在mRNA水平抑制VEGF、FGF、MMP13和DKK1的表達。這可能是達沙替尼治療Ra的重要機制，表明FLS可能是達