乳鏈菌肽耐受性調(diào)控新基因功能的研究.pdf

1、Nisin是由N血清型乳酸乳球菌產(chǎn)生的一種高度翻譯后修飾的多肽類細(xì)菌素。作為一種對(duì)人體無毒害的天然防腐劑,它被廣泛地應(yīng)用于食品工業(yè)、造紙、農(nóng)業(yè)飼料、生殖避孕、醫(yī)學(xué)移植等領(lǐng)域。
　　 Nisin可以抑制絕大多數(shù)革蘭氏陽性菌,主要通過抑制細(xì)胞壁合成,形成穿膜孔道引起胞內(nèi)小分子物質(zhì)外泄,誘導(dǎo)細(xì)菌自溶酶釋放或抑制孢子形成四種方式。為避免對(duì)自身菌體的破壞,由Nisin基因簇編碼的NisI和NisFEG四個(gè)蛋白協(xié)同作用,為產(chǎn)Nisin的乳酸

2、乳球菌提供了免疫保護(hù)。但近幾年的研究表明,不產(chǎn)Nisin的乳酸乳球菌也可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生對(duì)Nisin的耐受性,說明Nisin的免疫耐受系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。除了Nisin基因簇中的基因,乳酸乳球菌中還有很多基因參與免疫耐受性的調(diào)控。
　　 本文選用一株Nisin高產(chǎn)的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis N8作為研究對(duì)象,利用人工Mu轉(zhuǎn)座技術(shù)構(gòu)建了含有1.800個(gè)突變子的文庫。從突變文庫中篩選

3、到一株Nisin免疫耐受性顯著增高的突變株,命名為L31。通過基因克隆、測(cè)序和遺傳定位,確定這個(gè)突變株Mu轉(zhuǎn)座子DNA插入的是一個(gè)功能未知的基因irpT。
　　 為了探索irpT基因參與Nisin免疫耐受調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可能機(jī)制,我們進(jìn)一步研究了它的生物學(xué)功能。首先,通過Southern雜交確定了突變株L31基因組中Mu轉(zhuǎn)座子DNA插入的唯一性,并使用同源基因序列分析和遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)排除了極性效應(yīng)的可能。比較分析irpT基因序列以及它編

4、碼的蛋白質(zhì)的基序,結(jié)果顯示它是一個(gè)具有跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白,可能與細(xì)菌的抗菌素抗性有關(guān)。Westernblotting結(jié)果顯示,IrpT蛋白不是通過影響免疫系統(tǒng)中的NisI和NisFEG來改變Nisin的免疫耐受的。雙向電泳結(jié)果顯示,IrpT蛋白的缺失造成5個(gè)蛋白的表達(dá)量的顯著改變:磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量明顯降低,而dTDP-L-鼠李糖合成酶、磷酸丙酮酸水合酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶和一個(gè)未知功能蛋白的表達(dá)量明顯升高。對(duì)編碼這些蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄

5、水平進(jìn)行研究,結(jié)果顯示irpT基因插入失活對(duì)這5個(gè)基因的影響與蛋白表達(dá)水平一致。說明irpT基因是通過影響上述5個(gè)基因的表達(dá)來改變?nèi)樗崛榍蚓鷮?duì)Nisin的耐受性。
　　 細(xì)胞壁合成與細(xì)菌素抗性的關(guān)系最為密切和直接,而dTDP-L-鼠李糖合成酶正是細(xì)胞壁骨架上多糖鏈的合成酶之一。檢測(cè)突變株L31細(xì)胞壁鼠李糖的含量顯示比野生株高13.7％,而且在Nisin敏感的乳酸乳球菌MG1363中過表達(dá)dTDP-L-鼠李糖合成酶會(huì)提高該菌對(duì)Ni