長正五聚蛋白3參與鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病發(fā)生發(fā)展過程的研究.pdf

1、目的：
　　鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病(Calcific aortic valve disease,CAVD)嚴(yán)重危害人類健康,近年來其發(fā)病率呈增高趨勢。在西方國家，年齡大于65歲人群中，大約有2.5％的人主動(dòng)脈瓣膜有不同程度的硬化、狹窄，其中一些人需要行心瓣膜置換手術(shù)治療。瓣膜間質(zhì)細(xì)胞是心臟瓣膜中的主要細(xì)胞，起支架作用，對維持瓣膜結(jié)構(gòu)完整性有重要作用。越來越多的研究證實(shí)主動(dòng)脈瓣膜鈣化并不是被動(dòng)的鈣磷無機(jī)鹽沉積，而是多種細(xì)胞和多種信號通路

2、介導(dǎo)的主動(dòng)性調(diào)控過程，其病理生理過程包括脂質(zhì)沉積等多種病理生理過程。
　　長正五聚蛋白3屬于正五聚蛋白家族成員，又稱腫瘤壞死因子刺激基因14（tumor necrosis factor-stimulated gene14,TSG14）。PTX3參與細(xì)胞凋亡、炎癥、免疫防御以及包括冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、急性主動(dòng)脈夾層、充血性心力衰竭等多種心血管疾病。PTX3由多種細(xì)胞產(chǎn)生(包括DCs、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及其他多種細(xì)胞)

3、。目前PTX3血漿水平異常已被證實(shí)與多種心血管疾病有關(guān),包括動(dòng)脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、充血性心力衰竭、主動(dòng)脈瓣狹窄等。在鈣化性主動(dòng)脈瓣膜中，已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞包括瓣膜間質(zhì)細(xì)胞均可表達(dá)PTX3，PTX3可能參與鈣化性主動(dòng)脈瓣膜病的發(fā)生發(fā)展，然而具體作用機(jī)制有待研究。
　　我們推測，oxLDL通過激活相關(guān)信號通路促進(jìn)PTX3的表達(dá)，從而誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)主動(dòng)脈瓣膜鈣化進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)通過體外不同措施干預(yù)瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，利用

4、分子生物技術(shù)，證實(shí)以上假設(shè)，并探討其中的機(jī)制。
　　方法與結(jié)果：
　　免疫組化染色實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：通過病史，臨床表現(xiàn)，體格檢查、心臟彩超及其他相關(guān)檢查，年齡＞60歲，診斷主動(dòng)脈瓣退行性病變的瓣膜標(biāo)本20例，排除風(fēng)濕性心臟瓣膜、感染性心內(nèi)膜炎瓣膜，為實(shí)驗(yàn)組。取心臟移植術(shù)中無主動(dòng)脈瓣膜病變的瓣膜12例為對照組。術(shù)中取下瓣膜后，立即用4％多聚甲醛固定24小時(shí)后石蠟包埋，普通切片機(jī)切成4μm厚縱向置于載玻片上，行免疫組化染色，包括α-SM

5、A、CD68、RUNX2、PTX3。
　　與對照組比較，鈣化主動(dòng)脈瓣膜中α-SMA、CD68、RUNX2、PTX3水平均顯著提高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：在鈣化的主動(dòng)脈瓣膜中PTX3表達(dá)增加與成骨因子表達(dá)增加表現(xiàn)為相同的變化趨勢。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)：體外培養(yǎng)AVICs，用不同濃度oxLDL（25、50、100 ug/mL）干預(yù)24h，免疫印跡法檢測PTX3，干預(yù)48小時(shí)后檢測RUNX2、Osteocalcin的表達(dá)

6、，用oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)不同時(shí)間后，檢測PTX3表達(dá);采用Toll4樣受體靶向小干擾RNA（TLR4 siRNA）及PTX3靶向小干擾RNA（PTX3 siRNA）轉(zhuǎn)染VICs沉默TLR4及PTX348h，蛋白免疫印跡法檢測Toll4和PTX3的表達(dá)；Toll4 siRNA及PTX3siRNA轉(zhuǎn)染AVICs48h后再給予oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)AVICs，蛋白免疫印跡法檢測PTX3、RUNX2、Osteoca

7、lcin的表達(dá)水平，以及PTX3 siRNA轉(zhuǎn)染AVICs48h后再給予oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)AVICs1周后行茜素紅染色；OxLDL干預(yù)10min、30min、1h、2h、4h后，蛋白免疫印跡法檢測pNF-kB、pERK1/2水平；用NF-kB通路阻滯劑BAY11-7082和ERK1/2通路阻滯劑PD98059預(yù)先1h加入培養(yǎng)基，再分別用oxLDL及重組人PTX3干預(yù)48h后，蛋白免疫印跡法檢測RUNX2、Osteoca

8、lcin的表達(dá)水平；用重組人PTX3蛋白（100nmol）干預(yù)VICs10min、30min、1h、2h、4h后，蛋白免疫印跡法檢測pNF-kB、pERK1/2水平，干預(yù)48h后檢測RUNX2、Osteocalcin的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1.不同濃度oxLDL干預(yù)AVICs表達(dá)PTX3、RUNX2、Osteocalcin均呈濃度依賴性增加，用oxLDL(100ug/mL)干預(yù)時(shí)，PTX3在24h的表達(dá)達(dá)到最高峰（P<0.01）；2.TL

9、R4 siRNA、PTX3 siRNA組較對照組比較可有效沉默Toll4、PTX3的表達(dá)（P<0.01）；3.與對照組比較，oxLDL+Toll4 siRNA組AVICs PTX3、Runx2、osteocalcin的表達(dá)明顯減少；與對照組比較，oxLDL+PTX3 siRNA組AVICs成骨因子的表達(dá)明顯減少（P<0.05），茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)明顯減少；4.沉默Toll4和PTX3后pNF-kB、pERK1/2、RUNX2、Osteoc

10、alcin的表達(dá)水平明顯減少（P<0.01）；5.與對照組比較，rhPTX3組成骨因子表達(dá)明顯上調(diào)，與單純oxLDL組比較，oxLDL+rhPTX3進(jìn)一步上調(diào)成骨因子的表達(dá)；6.與單純r(jià)hPTX3組比較，BAY11-7082+rhPTX3組、PD98059+rhPTX3組成骨因子表達(dá)減少。
　　結(jié)論：
　　本研究初步探討了PTX3在主動(dòng)脈瓣膜鈣化中的作用及機(jī)制：OxLDL通過激活TLR4，上調(diào)PTX3的表達(dá)。PTX3通過促進(jìn)