缺氧條件下血府逐瘀湯影響EphB4-EphrinB2信號(hào)促血管新生的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　以人微血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC-1為研究對(duì)象，探討缺氧條件下血府逐瘀湯含藥血清不同濃度(1.25％，2.5％，5％)與血管新生活動(dòng)中EphrinB2和EphB4的關(guān)系。從細(xì)胞水平、分子水平探討血府逐瘀湯對(duì)EphB4/EphrinB2信號(hào)的影響，從而為血府逐瘀湯調(diào)控血管新生的機(jī)制和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)佐證。
　　方法:
　　1.制備大鼠血府逐瘀湯含藥血清和空白血清。SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體重(230±10)g

2、，隨機(jī)分為藥物組和空白對(duì)照組2組，每組30只，由校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。參照人和動(dòng)物間用藥劑量的換算，藥物組以人口服劑量12倍，即0.41 g/kg灌胃，生理鹽水組以等量生理鹽水灌胃，血府逐瘀膠囊按劑量溶于生理鹽水中，連續(xù)灌胃7天，2次/天，于第8天灌胃后兩小時(shí)注射戊巴比妥鈉（2％濃度，0.75 ml/kg）腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，4000r/min離心30min后分離血清，56℃，30min水浴滅活，無菌室超凈工作臺(tái)上用0.22μm的

3、針式過濾器過濾除菌，分裝，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.常規(guī)培養(yǎng)HMEC-1細(xì)胞。將11.6g MCDB-131干粉培養(yǎng)基和1.18g碳酸氫鈉完全溶解于超純水中，定容到1000ml，調(diào)整pH值到7.2-7.4，4℃冰箱過夜，次日過濾除菌，分裝備用。在配制好的培養(yǎng)基原液中按比例加入EGF，氫化可的松和胎牛血清，配制成完全培養(yǎng)基（MCDB-131培養(yǎng)液、EGF、氫化可的松、胎牛血清按88∶1∶1∶10比例配置），4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?/p>

4、培養(yǎng)基原液中加入胎牛血清制成濃度5％的實(shí)驗(yàn)用培基，實(shí)驗(yàn)中用于配制不同濃度(1.25％、2.5％、5％)的含藥血清。
　　3.管腔形成實(shí)驗(yàn)。同血清含量的藥物組和空白組缺氧培氧箱（O2濃度1％）培養(yǎng)24h、48h和72h后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿取出，將細(xì)胞用胰酶消化下來，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要計(jì)數(shù)，按一定密度稀釋并接種于預(yù)制的基質(zhì)膠上，繼續(xù)培養(yǎng)5小時(shí)，倒置顯微鏡高倍鏡下(200×)隨機(jī)選取視野拍照，計(jì)算管腔形成數(shù)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較相同血清含量條件下藥物組和

5、空白組的差異。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)EphB4和EphrinB2基因的轉(zhuǎn)錄。Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)布的基因序列，應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)靶基因和β-actin的引物。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)情況，用2-△△CT相對(duì)定量法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　5.免疫印跡法檢測(cè)EphB4/EphrinB2和磷酸化Ephrin32的表達(dá)。提取細(xì)胞總蛋白，用BCA蛋白定量法檢測(cè)蛋白濃度確定蛋白上

6、樣量。對(duì)提取的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡到PVDF膜上。封閉液封閉，一抗4℃孵育過夜，二抗孵育并檢測(cè)條帶，比較表達(dá)差異。
　　結(jié)果:
　　1.管腔形成實(shí)驗(yàn):與相同血清含量的空白血清組比較，24 h作用時(shí)間段2.5％和5％含藥血清濃度表現(xiàn)為促進(jìn)血管形成作用，48 h作用時(shí)間段只有5％含藥血清組對(duì)管腔的形成數(shù)量起到促進(jìn)作用。而72 h三個(gè)濃度含藥血清組對(duì)管腔形成均無促進(jìn)作用。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定

7、量PCR:選取濃度為2.5％的含藥血清組干預(yù)6h、12h、24h、48h，EphrinB2在含藥血清干預(yù)6h、12h后皆上調(diào)表達(dá)(P＜0.01)，EphB4在干預(yù)12h后下調(diào)表達(dá)。而繼續(xù)干預(yù)24h和48h后，基因轉(zhuǎn)錄水平與同等血清含量空白血清組比較，二者都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.Western Blot蛋白印跡:含藥血清組EphrinB2蛋白表達(dá)量在9h和24h明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.05)。EphB4蛋白表達(dá)量在12h低于