EphB4-ephrinB2反向信號(hào)在血府逐瘀湯促血管新生中的作用研究.pdf

1、血管生成是在原有血管結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，由不同信號(hào)參與并刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、粘附，甚至是誘導(dǎo)血管周?chē)?xì)胞核胞外基質(zhì)重構(gòu)的多步驟過(guò)程。內(nèi)皮細(xì)胞受體酪氨酸激酶是調(diào)節(jié)血管新生的重要因素，其代表性家族成員血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和促血管生成素(angiopoietins)對(duì)血管新生的作用已得到證實(shí)并逐漸應(yīng)用于臨床。
　　 Eph是已知受體酪氨酸激酶家族(RTKs)中最大的亞家族，不同于其他RTKs成員同可溶性配體連接的特點(diǎn)，Eph通過(guò)

2、細(xì)胞接觸的形式同跨膜配體ephrin特異性結(jié)合。而配體ephrin主要發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移和粘附的作用。Eph/ephrin之間互為配-受體，形成雙向信號(hào)，參與體內(nèi)多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)，研究較為廣泛的是其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。此外，還有不少研究指出，Eph/ephrin在血管新生過(guò)程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，尤其是EphB4和ephrinB2在動(dòng)靜脈上的特異性分布
　　 以及配-受體相互作用形成的雙向信號(hào)，不僅調(diào)節(jié)胚胎期血管的發(fā)育，而且繼續(xù)影響

3、出生后血管新生。本課題組前期研究表明，血府逐瘀湯具有較好的促血管新生作用，且促血管新生作用與藥物濃度和作用時(shí)間呈倒U型關(guān)系，提示該藥具有促血管適度生長(zhǎng)的作用，有別于VEGF等的一味促血管生成，避免出現(xiàn)血管過(guò)度生長(zhǎng)。EphB4/ephrinB2在調(diào)節(jié)血管生成方面得到越來(lái)越多的肯定，而課題組應(yīng)用基因芯片技術(shù)觀(guān)察血府逐瘀湯對(duì)多種調(diào)控血管生成的因子的影響，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)配體ephrinB2呈上調(diào)表達(dá)。血府逐瘀膠囊在保持了血府逐瘀湯原方配伍的基礎(chǔ)上，對(duì)

4、劑型稍做改變，服用更加方面，而且可控性強(qiáng)，是的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更客觀(guān)可信。本實(shí)驗(yàn)用膠囊劑，目的在于探索血府逐瘀湯如何通過(guò)EphB4/ephrinB2信號(hào)通路促血管新生繼而發(fā)揮適度調(diào)控的作用。
　　 目的：
　　 通過(guò)觀(guān)察血府逐瘀含藥血清不同濃度(1.25％，2.5％，5％)下對(duì)體外成血管的影響，篩選出藥物促血管新生的最佳作用濃度和時(shí)間;并在最佳作用條件下研究藥物對(duì)EphB4/ephrinB2反向信號(hào)的調(diào)控。從細(xì)胞效應(yīng)、轉(zhuǎn)錄水平、

5、蛋白活性水平探討血府逐瘀湯在微血管內(nèi)皮細(xì)胞中對(duì)靶信號(hào)的作用機(jī)制，從而為血府逐瘀湯適度調(diào)節(jié)血管新生和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。
　　 方法：
　　 1、含藥血清的制備。
　　 將健康成年男性志愿者隨機(jī)分為藥物干預(yù)組和空白血清組。藥物組每日按要求服用二倍劑量的血府逐瘀湯，七天為一個(gè)周期，最后一次服藥2小時(shí)后每人左靜脈采集血液50ml，高速離心制備成含藥血清，56℃水浴30分鐘滅活補(bǔ)體;隨后在無(wú)菌操作下用微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾，

6、分裝后置于-20℃冰箱備用?？瞻籽褰M不做任何干預(yù)，血清制備收集方法同藥物血清。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分組。
　　 將常規(guī)培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC-1）隨機(jī)分為6組:血清含量分別為1.25％、2.5％、5％的空白血清干預(yù)組和藥物血清干預(yù)組，每組血清均按比例溶于含5％胎牛血清(FBS)的MCDB-131培養(yǎng)基中。
　　 3、采用基質(zhì)膠檢測(cè)藥物對(duì)HMEC-1體外成血管能力的影響。
　　 不同血清含量的藥物組

7、和空白組分別干預(yù)24h、48h和72h，應(yīng)用In VitroAngiogenesis Assay試劑盒，37℃溫箱培養(yǎng)4小時(shí)后倒置顯微鏡高倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)量，比較相同血清含量下藥物組和空白組間的差異，并挑選出最佳藥物濃度和作用時(shí)間。
　　 4、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)EphB4/ephrinB2表達(dá)。
　　 用Trizol法提取總RNA，取純度合格的RNA適量，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)布的基因序列，

8、應(yīng)用Primer5軟件設(shè)計(jì)靶基因和β-actin的引物。然后采用SYBR Green試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)情況，用2-△△CT相對(duì)定量法進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 5、免疫印跡法檢測(cè)EphB4/ephrinB2的表達(dá)和磷酸化表達(dá)。
　　 提取全細(xì)胞蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白含量確定上樣量。電泳對(duì)提取樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕轉(zhuǎn)法將蛋白印跡到0.45um孔徑的PVDF膜上。非磷酸化抗體用5％脫脂奶粉封閉，磷酸化抗體用5％牛

9、血清白蛋白(BSA)封閉，之后放入稀釋后的一抗中4℃孵育過(guò)夜，次日室溫孵育二抗，并用化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)條帶，比較表達(dá)差異。
　　 6、EphB4/ephrinB2反向信號(hào)在血府逐瘀含藥血清促血管適度生長(zhǎng)中的作用。
　　 在空白血清組加入EphB4/fc作為反向信號(hào)激活劑組，在含藥血清中加入PP2作為反向信號(hào)抑制劑組。各組選擇不同的作用時(shí)間點(diǎn)和作用濃度，并應(yīng)用體外成血管技術(shù)分別比較激活劑組、抑制劑組與含藥血清組成血管能力的差

10、異，對(duì)反向信號(hào)在血府逐瘀湯促血管適度生長(zhǎng)的作用進(jìn)行細(xì)胞效應(yīng)評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清含量的差異影響細(xì)胞活性，以48小時(shí)體外成血管為例，1.25％和2.5％空白血清的血管生成能力明顯弱于5％空白血清(P＜0.05)，說(shuō)明血清含量不同會(huì)對(duì)結(jié)果有影響;所以，本實(shí)驗(yàn)將同等血清含量的藥物組及空白組進(jìn)行對(duì)比，使得結(jié)果更為客觀(guān)。
　　 2、體外成血管實(shí)驗(yàn):2.5％含藥血清干預(yù)48h促血管新生效果肯定(P＜0.05)，

11、5％含藥血清干預(yù)48h、72h后抑制血管新生的效果顯著(P＜0.01)。選定2.5％藥物血清干預(yù)48h為促血管新生最佳條件。
　　 3、實(shí)時(shí)定量PCR:2.5％藥物血清干預(yù)12小時(shí)之內(nèi)的多個(gè)時(shí)間段，EphB4-mRNA和ephrinB2-mRNA表達(dá)均未見(jiàn)明顯上調(diào)或下調(diào)。在隨后的時(shí)間點(diǎn)，EphB4-mRNA于12h上調(diào)(P＜0.05)，24h下調(diào)(P＜0.01)，48h無(wú)明顯變化;EphrinB2-mRNA的表達(dá)則是在12h、2

12、4h和48h多個(gè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯波動(dòng)。
　　 4、Western Blot結(jié)果:2.5％藥物血清干預(yù)24h，EphrinB2表達(dá)有顯著提高(P＜0.01)，反向信號(hào)ephrinB2磷酸化活化水平在9小時(shí)有較明顯升高(P＜0.05)。
　　 5、在藥物最佳作用條件下，分別激活和阻斷EphB4/ephrinB2反向信號(hào)的傳遞，通過(guò)比較含藥血清組與最佳濃度激活劑組體外成血管數(shù)目，證實(shí)藥物干預(yù)組與反向信號(hào)激活劑組在促血管新生方面作

13、用相當(dāng)(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、血府逐瘀湯能雙向調(diào)控血管生長(zhǎng)，不同藥物濃度或是同一藥物濃度不同作用時(shí)間對(duì)血管生成的影響不同，不僅能促血管新生，而且還能發(fā)揮抑制作用。
　　 2、血府逐瘀湯干預(yù)9h，反向通路受體活性狀態(tài)EphrinB2磷酸化水平顯著升高，結(jié)合反向信號(hào)刺激劑和抑制劑的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，充分說(shuō)明藥物促血管新生作用與激活EphB4/ephrinB2反向信號(hào)通路有關(guān)。
　　 3、血府逐瘀湯