分子信標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)對癌癥基因(p53和Kras)診斷的應(yīng)用.pdf

1、人體是一個復(fù)雜的開放性系統(tǒng)，由自身的遺傳因素、環(huán)境因素或者二者共同作用引起的疾病，將對生命產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅。若能對產(chǎn)生疾病的原因及其性質(zhì)進(jìn)行確定，就能夠進(jìn)行早診斷、早預(yù)防和早治療。分子生物學(xué)技術(shù)通過對人類基因的鑒別和診斷，人類從分子水平上更好的認(rèn)識和了解疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。癌癥被稱為21世紀(jì)最兇惡的疾病之一，是由癌基因、生長因子及其受體基因的活化以及抗癌基因的失活或丟失而產(chǎn)生，它屬于一種基因突變型疾病。對于癌癥這種疾病，只有做出盡早的確

2、診，并進(jìn)行相應(yīng)的治療措施，患者才能具有生存的可能。以往癌癥的檢測方法主要有體格檢查、各種影像檢查、化驗檢測、抗原抗體反應(yīng)和酶學(xué)檢測等。目前，隨著對生物大分子分析的研究進(jìn)展，基因技術(shù)的異軍突起對臨床疾病診斷產(chǎn)生了重要的影響。可以說，腫瘤診斷最終將使用基因診斷，基因技術(shù)不僅能夠?qū)Π┌Y進(jìn)行診斷，而且也可以用來治療癌癥。
　　分子信標(biāo)是根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則和熒光共振能量轉(zhuǎn)移巧妙設(shè)計而成。分子信標(biāo)是一種新型的核酸探針，通常是將一個熒光基團(tuán)和

3、一個淬滅基團(tuán)分別修飾在分子信標(biāo)的兩端，將被檢測物質(zhì)的信息通過熒光信號表達(dá)出來。分子信標(biāo)探針具有高特異性、高選擇性、高靈敏度、高穩(wěn)定性、易于修飾、序列多變和識別多元化等優(yōu)點，在生物傳感與生化分析的新方法建立方面得到了越來越多的重視和應(yīng)用。
　　基于以上考慮，綜合文獻(xiàn)報道，本論文以核酸作為生物大分子研究對象，利用多種核酸工具酶和熒光分子信標(biāo)探針技術(shù)，建立了一系列簡便、快速的生物大分子熒光信號放大檢測技術(shù)平臺，在核酸定量分析、點突變(p

4、oint mutation)檢測、多重單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)基因分型等分析方面得到重要應(yīng)用。本論文主要分為三個部分，現(xiàn)簡介如下:
　　(1)核酸內(nèi)切酶信號放大和滾環(huán)信號放大協(xié)同作用對p53基因的高靈敏檢測。核酸工具酶信號放大技術(shù)和滾環(huán)信號放大技術(shù)由于具有高靈敏度、高特異性和等溫操作等諸多優(yōu)點，在生物化學(xué)分析和臨床疾病診斷中具有很好的應(yīng)用前景。本部分設(shè)計了一種簡單的

5、單發(fā)卡分子信標(biāo)，當(dāng)與目的基因結(jié)合后，在聚合酶的作用下形成互補(bǔ)雙鏈，核酸內(nèi)割酶對雙鏈進(jìn)行識別切割，切割下來的片段，能夠同時進(jìn)行打開分子信標(biāo)和發(fā)生滾環(huán)反應(yīng)，把兩種技術(shù)結(jié)合起來實現(xiàn)對p53目的基因的診斷檢測。此外，這個方法能對目的DNA進(jìn)行超靈敏的檢測，在1×10-9-4×10-5M濃度范圍內(nèi)檢測下限達(dá)到1 pM。另外，由于分子信標(biāo)和目標(biāo)DNA特異性的識別能力，我們的實驗方案可以對于單基因突變能進(jìn)行很好的區(qū)分，此方案具有較好的特異性。最后，對

6、于實際樣品細(xì)胞實驗也取得了較為滿意的結(jié)果。
　　(2)雙發(fā)卡分子信標(biāo)信號擴(kuò)大對于癌癥相關(guān)基因的檢測。本實驗部分設(shè)計了一個獨特的雙發(fā)卡分子信標(biāo)探針，當(dāng)靶基因與雙發(fā)卡分子信標(biāo)進(jìn)行雜交后，打開的分子信標(biāo)能夠和另外一個分子信標(biāo)進(jìn)行雜交形成二聚體，從而實現(xiàn)對靶核酸的熒光信號放大檢測。通過選擇癌癥相關(guān)的Kras基因作為目的DNA，雙發(fā)卡分子信標(biāo)能夠在均質(zhì)的介質(zhì)中對其進(jìn)行檢測，不需要任何其他的外援性探針參與。此外，對于這個靈敏系統(tǒng)能夠形成1∶2

7、的化學(xué)計量比，解決了傳統(tǒng)的分子信標(biāo)1∶1反應(yīng)的缺陷。再者，此反應(yīng)體系不需要任何酶的參與，避免了反應(yīng)產(chǎn)物污染，并且設(shè)計簡單、操作簡便快捷、在等溫條件下反應(yīng)，靈敏度高，檢測下限可達(dá)到50 pM，線性范圍可以達(dá)到三個數(shù)量級。更加引人注意的是，目的基因中的點突變能夠較容易的篩選。雙發(fā)卡分子信標(biāo)能夠作為具有前景的不同DNA探針替代品，應(yīng)用在生物分子研究和臨床基因診斷中。
　　(3)切割酶信號放大耦合滾環(huán)反應(yīng)雙發(fā)卡分子信標(biāo)對Kras基因的靈敏

8、檢測。為了進(jìn)一步說明分子信標(biāo)在生化分析中的優(yōu)越性，本部分實驗內(nèi)容以Kras基因作為靶待測目標(biāo)物質(zhì)，雙發(fā)卡分子信標(biāo)為檢測探針，耦合核酸內(nèi)切酶信號放大技術(shù)和滾環(huán)信號放大技術(shù)，構(gòu)建了生物基因檢測體系，考察了分子信標(biāo)信號放大檢測體系的分析性能。沒有目標(biāo)DNA時，雙發(fā)卡分子信標(biāo)成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)緊靠在一起發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，不顯示熒光信號;有待測物質(zhì)時，雙發(fā)卡分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)打開，形成互補(bǔ)的雙鏈結(jié)構(gòu)，在核酸內(nèi)切酶的識別切割作用下，切割下來的