腎小管上皮細胞缺氧狀況下細胞外基質代謝特點初步解析.pdf

1、背景及目的：
　　細胞外基質過度產(chǎn)生和降解減少是腎小管基底膜增厚的根本原因，但內(nèi)在機制尚未完全研究清楚，如果能掌握細胞外基質代謝相關基因活動全貌將有助于闡明內(nèi)在規(guī)律?；|金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase2，MMP-2）是降解基底膜膠原的關鍵酶。體外研究發(fā)現(xiàn)，缺氧抑制腎小管上皮細胞MMP-2活性。然而，缺氧為什么引起MMP-2活性下降？調控機制至今仍未研究清楚。
　　方法：
　　1.缺氧腎

2、小管上皮細胞轉錄組分析
　　用RNA測序方法，分別檢測缺氧和常氧處理的腎小管上皮細胞整個轉錄組的變化。
　　2.缺氧狀況下，分別上調和下調自噬與內(nèi)吞RAB7、自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑、自噬和內(nèi)吞關鍵蛋白下調對MMP-2活性、表達和活性調節(jié)蛋白的影響。
　　首先構建上調和下調RAB7基因載體;再用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和菲律平(filipin)分別處理細胞;接著下調自噬(Beclin-1)和內(nèi)吞（Caveolin-1）

3、的關鍵分子。用Zymography法分別測上清MMP-2活性;qRT-PCR檢測細胞內(nèi)MMP-2表達;ELISA方法測培養(yǎng)上清MMP-2和Ⅳ型膠原蛋白含量;Western blotting檢測酶活性調節(jié)蛋白MMP-14、RECK、TIMP-2表達。
　　結果：
　　1.缺氧腎小管上皮細胞轉錄組分析
　　獲得2倍上調、下調以及統(tǒng)計學檢驗水平P＜0.05的基因共279個。與腎臟病相關的上調基因主要為:細胞外基質與受體相互作

4、用、腎細胞癌、血管內(nèi)皮生長因子、轉化生長因子等;與腎臟病相關的下調基因主要為:抗原處理和遞呈、內(nèi)質網(wǎng)蛋白處理、能量產(chǎn)生、谷胱甘肽生成等。此外，還檢測到缺氧細胞有51387選擇性剪接、常氧細胞有49144選擇性剪接和新轉錄組9394個以及單核苷酸多態(tài)性(SNP)69706個。
　　2.缺氧狀況下，上調和下調自噬和內(nèi)吞共享分子RAB7對MMP-2活性、表達和活性調節(jié)蛋白的影響
　　缺氧腎小管上皮細胞在上調RAB7基因的表達后，培

5、養(yǎng)上清中MMP-2活性下降（缺氧+RAB7組:0.10±0.06;缺氧組:0.48±0.07，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達水平下降(缺氧+RAB7組:0.81±0.08;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01)、MMP-2蛋白含量減少（缺氧+RAB7組:2.52±0.26μg/L;缺氧組:3.81±0.13μg/L，P＜0.01）、Ⅳ型膠原蛋白含量升高（缺氧+RAB7組:5.65±0.20μg/L;缺氧組:5.43±0.1

6、7μg/L，P＞0.05）;下調RAB7基因的表達，MMP-2活性明顯升高（缺氧+RAB7shRNA組:1.00±0.08;缺氧組:0.48±0.07，P＜0.01）、MMP-2mRNA表達升高（缺氧+RAB7shRNA組:3.80±0.23;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量增加（缺氧+RAB7 shRNA組:4.31±0.30μg/L;缺氧組:3.81±0.13μg/L，P＜0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量減

7、少(缺氧+RAB7shRNA組:5.01±0.20μg/L;缺氧組:5.43±0.17μg/L，P＜0.01)。
　　缺氧腎小管上皮細胞上調RAB7基因的表達，酶活性調節(jié)蛋白TIMP-2和MMP-14表達下降;下調RAB7基因的表達，TIMP-2和MMP-14蛋白表達升高。與缺氧組相比，無論上調還是下調RAB7基因表達，酶活性調節(jié)蛋白RECK表達均下降;下調RAB7表達之后，RECK表達下降尤其明顯（P＜0.01）。
　　3

8、.缺氧狀況下，自噬和內(nèi)吞特異性抑制劑對MMP-2活性、表達和活性調節(jié)蛋白的影響
　　在缺氧條件下抑制自噬，培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低（缺氧+3-MA組:0.25±0.04;缺氧組:0.36±0.07，P＞0.05）、MMP-2 mRNA表達水平大幅提升(缺氧+3-MA組:15.53±2.12;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01)、MMP-2蛋白含量無顯著變化（缺氧+3-MA組:3.67±0.20μg/L;缺氧組:3.71

9、±0.12μg/L，P＞0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量略增加（缺氧+3-MA組:5.46±0.061μg/L;缺氧組:5.33±0.14μg/L，P＞0.05）;抑制內(nèi)吞能顯著恢復MMP-2活性（缺氧+filipin組:0.60±0.08;缺氧組:0.36±0.07，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達上調（缺氧+filipin組:6.40±2.22;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量顯著增加（缺氧+fil

10、ipin組:4.44±0.31μg/L;缺氧組:3.71±0.12μg/L，P＜0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量有所下降（缺氧+ filipin組:5.18±0.02μg/L;缺氧組:5.33±0.14μg/L，P＞0.05）。
　　在缺氧情況下3-MA、filipin均抑制TIMP-2的表達，而3-MA抑制效果更明顯。3-MA和filipin都抑制RECK的表達。filipin對MMP-14的表達水平有明顯上調作用。用免疫熒光實驗驗

11、證調控分子的變化，所得結果一致。
　　4.缺氧狀況下，自噬和內(nèi)吞關鍵蛋白下調對MMP-2活性、表達和活性調節(jié)蛋白的影響
　　缺氧情況下干擾Bec-1基因表達，培養(yǎng)上清MMP-2活性有所降低（缺氧+Bec-1shRNA組:0.35±0.17;缺氧組:0.49±0.02，P＞0.05）、MMP-2 mRNA表達水平升高（缺氧+Bec-1shRNA組:2.00±0.03;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.05）、MMP-2蛋白含

12、量無顯著變化（缺氧+Bec-1shRNA組:3.30±0.18μg/L;缺氧組:3.54±0.20μg/L，P＞0.05）、Ⅳ型膠原蛋白含量亦無顯著變化（缺氧+Bec-1 shRNA組:5.45±0.28μg/L;缺氧組:5.30±0.20μg/L，P＞0.05）;干擾Cav-1基因表達，培養(yǎng)上清MMP-2活性升高（缺氧+Cav-1 shRNA組:0.66±0.05;缺氧組:0.49±0.02，P＜0.01）、MMP-2 mRNA表達水

13、平顯著升高（缺氧+Cav-1 shRNA組:15.80±3.11;缺氧組:1.24±0.16，P＜0.01）、MMP-2蛋白含量顯著增加（缺氧+Cav-1 shRNA組:4.15±0.26μg/L;缺氧組:3.54±0.20μg/L，P＜0.01）、Ⅳ型膠原蛋白含量有所減少（缺氧+Cav-1 shRNA組:4.90±0.60μg/L;缺氧組:5.30±0.20μg/L,P＞0.05）。
　　缺氧狀況下下調Bec-1基因或Cav-1

14、基因表達，均能抑制TIMP-2的表達，Bec-1shRNA的抑制效果比Cav-1 shRNA抑制效果明顯。MMP-14的表達和T1MP-2的表達情況相似。下調Beclin-1基因或Cav-1基因表達，均能抑制RECK表達，Bec-1shRNA抑制效果遜于Cav-1shRNA。
　　結論：
　　1.結果提示，缺氧狀況下，損傷修復相關基因活動明顯增強導致細胞外基質產(chǎn)生增加;抗原處理和遞呈相關基因、內(nèi)質網(wǎng)蛋白處理相關基因、能量產(chǎn)生

15、相關基因、谷胱甘肽生成相關基因下調，提示缺氧使細胞抗損傷能力下降;腎細胞癌相關基因上調提示慢性腎臟病患者腎細胞癌發(fā)病率升高可能與腎組織缺氧有關。
　　2.從多角度證明，缺氧腎小管上皮細胞自噬與內(nèi)吞影響MMP-2的表達或活性。自噬主要抑制MMP-2mRNA表達;而內(nèi)吞則主要抑制MMP-2活性。
　　3.缺氧腎小管上皮細胞Cav-1介導的內(nèi)吞、RECK表達增加、TIMP-2和MMP-14表達下降均影響MMP-2活性，其中Cav-