丙戊酸鈉通過上調(diào)miR-34a的表達抑制SMAD4在前列腺癌中的表達.pdf

1、前列腺癌作為一種男性惡性腫瘤，在歐美等國非常常見。近年來隨著我國經(jīng)濟生活水平的提高，飲食及文化相關的發(fā)展，社會的老齡化及查體的普及，前列腺癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。前列腺癌患者發(fā)病時一般較晚，許多患者發(fā)現(xiàn)時已發(fā)生轉移，其最常見的轉移為骨轉移。而研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者的高病死率與其高轉移率密切相關，因此，人們越來越關注針對前列腺癌患者轉移相關的治療。
　　上皮間質(zhì)轉化(EMT)是指原位腫瘤細胞，在受到物理或化學因素的作用下，從

2、而失去了細胞極性、細胞間黏附等上皮細胞的特性，并獲得間質(zhì)細胞的特性時，轉化成為能夠向細胞外基質(zhì)侵襲并向遠處轉移的細胞。上皮間質(zhì)轉化(EMT)已被證實在前列腺癌轉移過程中發(fā)揮著重要作用，其調(diào)控機制由多個信號通路綜合參與引導，包括TGF-β、Notch、Wnt以及ERK/MAPK等通路。其中TGF-β/SMAD4通路對腫瘤特別是晚期時的EMT發(fā)展密切相關。SMADs是哺乳動物TGF-β超家族信號傳導的下游信號蛋白，它們可將TGF-β信號由細

3、胞膜轉導進入細胞核，并與DNA及一些轉錄因子相互作用。SMAD4即在TGF-β/SMAD4信號通路中起到關鍵的“渡船”的作用。因此當抑制SMAD4的表達時，可以抑制TGF-β通路信號傳遞，阻止上皮間質(zhì)轉化(EMT)在腫瘤細胞中發(fā)生。
　　近年來發(fā)現(xiàn)的miRNA是一組非編碼小RNA，其作用涉及眾多生理、病理過程，主要表現(xiàn)為抑制mRNA的翻譯或誘導其降解，從而改變靶蛋白的表達水平。關于miRNA的研究成為當前的熱點，大量研究證明miR

4、NA在不同的腫瘤中均有不同的表達，且發(fā)揮著重要的作用:例如部分miRNA對腫瘤細胞中的EMT起促進作用，而部分miRNA對腫瘤細胞中的EMT起抑制作用。因此將來治療腫瘤通過研究針對miRNA靶向治療藥物會有很大的發(fā)展前景。
　　目前大量的研究表明，丙戊酸鈉(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)細胞轉移并且相應的下調(diào)SMAD4蛋白表達水平。然而VPA對前列腺癌細胞中SMAD4表達產(chǎn)生調(diào)控的過程中，是否存在miRNA的參與，這其中涉及的具

5、體機制目前尚不清楚。如果通過實驗找到影響SMAD4表達的核心miRNA，就可以針對該miRNA的作用機制研究相關的藥物治療。這種針對性更強的治療可能會效果更好且可以減少并發(fā)癥，對前列腺癌的治療將有著重要的意義。
　　目的：
　　前期研究已證實丙戊酸鈉(VPA)可抑制前列腺癌(PCa)細胞轉移，并且能通過下調(diào)SMAD4表達水平阻斷EMT的發(fā)生。通過本實驗，我們研究丙戊酸鈉(VPA)通過何種途徑下調(diào)SMAD4蛋白表達水平，尋找是

6、否存在相關的miRNA與其調(diào)控密切相關，找到這種miRNA并探索能否通過該miRNA的調(diào)控，改變SMAD4的表達水平，從而確定其是否在SMAD4的表達過程中起到關鍵作用，為前列腺癌的治療尋找新的治療靶點。
　　方法：
　　我們通過使用www.targetscan.com查找可以與SMAD4互補結合miRNAs，然后通過在PubMed上搜索及進行文獻復習確定與VPA相關的miRNA，將同時與SMAD4及VPA相關的miRNA作

7、為我們的研究對象。
　　實驗設計首先培養(yǎng)兩種前列腺癌細胞株(PC3、LNCaP)，在應用VPA處理后，檢測SMAD4的蛋白和mRNA水平有無變化，變化有無統(tǒng)計學差異。再次用VPA處理前列腺癌細胞株，觀察是否對作為研究對象的miRNA表達水平產(chǎn)生影響。選擇應用VPA處理后的變化有統(tǒng)計學差異的miRNA進行下一步實驗。通過質(zhì)粒轉染技術，分別植入轉染相應miRNA前體及miRNA抑制劑后，檢測其對前列腺癌細胞中SMAD4表達的影響。選出

8、對SMAD4表達產(chǎn)生有統(tǒng)計學意義影響的miRNA作為最終目標。最后將通過相應的miRNA抑制劑將選出的目標miRNA的表達進行抑制，觀察其能否消除VPA對SMAD4的影響，以評價其是否在VPA抑制SMAD4的表達過程中起到關鍵的作用。
　　結果：
　　通過使用www.targetscan.com查找可以與SMAD4互補結合miRNAs，然后通過在PubMed上搜索及文獻復習確定與VPA相關的miRNA，我們將同時與SMAD4

9、及VPA相關的5種miRNA作為我們的研究對象進行實驗，分別是miR-20a，miR-34a，miR-124a,miR-144和miR-449a。
　　我們通過實驗再次驗證在經(jīng)過VPA處理后，前列腺癌細胞株中SMAD4的mRNA和蛋白的水平均明顯下調(diào)，且具有明顯的濃度依賴性。之后我們用VPA處理前列腺癌細胞株，從初步篩選的5種miRNA中，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-34a與miR-449a的表達水平在VPA處理后增加且具有統(tǒng)計學

10、意義，而對miR-124a，miR-144的表達則無明顯變化。因此我們將miR-20a、miR-34a與miR-449a作為下一步的研究目標。
　　我們通過質(zhì)粒轉染技術，在兩種前列腺癌細胞株(LNCaP、PC3 cells)中分別植入轉染miR-20a、miR-34a與miR-449a前體及miR-20a、miR-34a與miR-449a抑制劑后，發(fā)現(xiàn)通過轉染pre-miR-34a降低SMAD4的表達，而轉染pre-miR-20a

11、或者pre-miR-449a則均增加了SMAD4的表達，且SMAD4表達的變化均有統(tǒng)計學差異;而通過轉染miR-34a抑制劑，增加了SMAD4的表達;而轉染miR-20a或者miR-449a抑制劑，則均減少了SMAD4的表達。在前列腺癌細胞株LNCaP中，通過轉染miR-34a抑制劑后SMAD4表達的變化有統(tǒng)計學差異，而轉染miR-20a抑制劑或者miR-449a抑制劑后SMAD4表達的變化無統(tǒng)計學差異。在前列腺癌細胞株PC3 cell

12、s中，通過轉染pre-miR-34a抑制劑、pre-miR-20a抑制劑、pre-miR-449a抑制劑后SMAD4表達的變化均有統(tǒng)計學差異。通過實驗我們發(fā)現(xiàn)轉染miR-34a的前體及抑制物均能對SMAD4的蛋白及mRNA表達水平有顯著的影響，miR-34a在VPA影響SMAD4表達過程中應該起到重要作用，因此我們選擇miR-34a作為研究對象進入下一組實驗。
　　在兩種前列腺癌細胞株(LNCaP、PC3 cells)中，通過轉染

13、pre-miR-34a抑制劑來增加SMAD4蛋白水平的表達，然后再加用VPA處理，SMAD4蛋白水平并沒有明顯改變，無統(tǒng)計學差異。同時在兩種前列腺癌細胞株(LNCaP、PC3 cells)中，應用轉染pre-miR-34a抑制劑后再應用VPA處理，SMAD4的mRNA水平的變化也無統(tǒng)計學差異。結果表明降低miR-34a的表達可消除VPA對SMAD4的抑制效果。即上調(diào)miR-34a水平可模擬SMAD4被VPA抑制時的效果，而下調(diào)miR-3

14、4a的水平消除VPA在前列腺癌細胞的影響。
　　結論：
　　丙戊酸鈉(VPA)可上調(diào)miR-20a，miR34a，miR449a在前列腺癌細胞株LNCaP和PC3中的表達水平。
　　抗癌miRNA中的miR-449a在經(jīng)過VPA治療后其表達明顯上調(diào)，這提示miR-449a可能參與VPA的其它復雜的作用機制。
　　pre-miR-20a或pre-miR-449a轉染誘導了SMAD4蛋白水平上調(diào)，這可能主要是由于間接