丙戊酸抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲力與SMAD4相關(guān)性的研究.pdf

1、研究背景：
　　近年來(lái)，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率明顯呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。隨著前列腺癌的進(jìn)展，有相當(dāng)一部分患者出現(xiàn)了骨骼、肺部等轉(zhuǎn)移，使預(yù)后變得較差。針對(duì)前列腺癌的轉(zhuǎn)移行為的研究已經(jīng)成為近年來(lái)的關(guān)注熱點(diǎn)之一。研究表明，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移行為的關(guān)鍵啟動(dòng)步驟，而TGF-β則是公認(rèn)的誘導(dǎo)EMT發(fā)生的主要因素。研究表明，SMAD4蛋白在介導(dǎo)TGF-β調(diào)控EMT的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用;然而，也有觀點(diǎn)認(rèn)為SMAD4在

2、前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著抑制性作用。關(guān)于SMAD4在前列腺癌進(jìn)展中的作用，目前尚無(wú)定論。結(jié)合當(dāng)前的研究現(xiàn)狀，組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)能夠在多方面抑制前列腺癌的進(jìn)展，包括增殖、自嗜、血管生成以及EMT等，是一類強(qiáng)有力的前列腺癌抑制劑。目前，關(guān)于HDACi類藥物抑制前列腺癌EMT的作用是否與調(diào)控SMAD4的表達(dá)水平有關(guān)，尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。
　　目的：
　　研究HDACi類藥物丙戊酸(VPA)對(duì)前列腺癌細(xì)胞株DU

3、145和PC3的侵襲能力的影響，以及同時(shí)對(duì)SMAD4表達(dá)水平的影響，探討SMAD4在VPA抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲過(guò)程中發(fā)揮的作用。
　　方法：
　　在所有的實(shí)驗(yàn)分組中，VPA的處理時(shí)間均為48h，PC3和DU145細(xì)胞均置于5％CO2、37℃下的恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　1.Transwell實(shí)驗(yàn):將前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145各自分為對(duì)照組、VPA2.0mM/L實(shí)驗(yàn)組和VPA5.0mM/L實(shí)驗(yàn)組，將PC3和DU145

4、細(xì)胞分別經(jīng)過(guò)相應(yīng)濃度的VPA處理48h后，接種于預(yù)鋪膠的Transwell小室的上室中，在給予相同濃度的胎牛血清刺激的條件下培養(yǎng)48h后，取出小室并固定、染色，然后于鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)，觀察VPA處理后PC3和DU145細(xì)胞的侵襲能力的改變;
　　2.免疫熒光檢測(cè):將前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145各自分為對(duì)照組和VPA5.0mM/L實(shí)驗(yàn)組，將PC3和DU145細(xì)胞接種于蓋玻片上，并置于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，分別經(jīng)過(guò)相應(yīng)濃

5、度的VPA處理48h后，經(jīng)過(guò)固定、打孔、抗體孵育、洗脫等步驟后，置于熒光顯微鏡下觀察PC3和DU145細(xì)胞中SMAD4的定位部位以及表達(dá)水平;
　　3.Westernblot檢測(cè):將前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C3和DU145各自分為對(duì)照組、VPA2.0mM/L實(shí)驗(yàn)組和VPA5.0mM/L實(shí)驗(yàn)組，將PC3和DU145細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)，分別經(jīng)過(guò)相應(yīng)濃度的VPA處理48h后，應(yīng)用BCA試劑盒法提取SMAD4蛋白、p-AKT蛋白并測(cè)定蛋白濃度

6、，經(jīng)過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體孵育等步驟后，應(yīng)用ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)PC3和DU145細(xì)胞各組中SMAD4蛋白以及p-AKT蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.Transwell實(shí)驗(yàn):VPA能夠明顯地抑制PC3和Du145細(xì)胞的侵襲能力，且抑制水平與VPA的濃度成正相關(guān)(p＜0.01);
　　2.免疫熒光實(shí)驗(yàn):熒光標(biāo)記后的SMAD4主要表達(dá)于PC3和Du145細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)熒光強(qiáng)度較微弱，這與SMAD4的功能學(xué)相符合;

7、VPA處理組的SMAD4蛋白熒光強(qiáng)度明顯弱于對(duì)照組的熒光強(qiáng)度;
　　3.Westernblot實(shí)驗(yàn):VPA抑制了p-AKT的表達(dá)水平（劑量依賴，p＜0.05），這與本課題組前期發(fā)表的研究結(jié)果一致，證明VPA在本實(shí)驗(yàn)中確實(shí)發(fā)揮了作用;VPA同時(shí)也明顯地抑制了Du145(p＜0.05)和PC3(p＜0.01)細(xì)胞內(nèi)SAMD4蛋白的表達(dá)水平，并且抑制程度與VPA濃度成正比。
　　結(jié)論：
　　VPA能夠明顯地抑制前列腺癌細(xì)胞P