Skp2與前列腺癌細(xì)胞紫杉醇耐藥相關(guān).pdf

1、目的：
　　前列腺癌（Prostate cancer，Pca）是歐美國家最常見的惡性腫瘤，我國的男性前列腺癌發(fā)病率近年來呈上升趨勢。去勢抵抗性前列腺癌通?？刹捎米仙即嫉然?，但最終也會引起紫杉醇耐藥而導(dǎo)致治療失敗。因此，臨床前列腺癌治療急需找到激素抵抗性和耐藥的前列腺癌新的治療靶點。本文研究S期激酶相關(guān)蛋白(S-Phase Kinase-Associated Protein2,Skp2)及其抑制劑對人前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞PC-3

2、-Txr和 DU145-TxR增殖和活力的影響，為前列腺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1應(yīng)用MTS的方法檢測本實驗室已構(gòu)建的雄激素抵抗紫杉醇耐藥細(xì)胞PC-3-TxR和DU145-TxR的耐藥指數(shù)。
　　blot的方法檢測2應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR和Western Skp2、Fbxw8、CUL1-7等Cullin-Ring E3連接酶亞單位在前列腺癌親本細(xì)胞和紫杉醇耐藥細(xì)胞的表達(dá)。
　　3慢病

3、毒介導(dǎo)Skp2ShRNA干擾PC-3-TxR和DU145-TxR細(xì)胞Skp2的表達(dá)。應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR和Western blot方法檢測Skp2干擾效率。
　　4應(yīng)用MTS的方法檢測Skp2干擾以及Skp2抑制劑聯(lián)合化療藥物紫杉醇對前列腺癌耐藥細(xì)胞增殖作用的影響。
　　5利用Western blot方法檢測Skp2的底物例如p21，p27和FOXO1在前列腺癌親本細(xì)胞和紫杉醇耐藥細(xì)胞的表達(dá)。
　　6應(yīng)用實時熒

4、光定量RT-PCR和Western blot的方法檢測EMT標(biāo)志物E-cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平在前列腺癌親本細(xì)胞和紫杉醇耐藥的前列腺癌細(xì)胞的表達(dá)。進(jìn)一步檢測shRNA干擾Skp2表達(dá)對前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞PC-3-TxR和DU145-TxR cadherin和Vimentin mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響。E-
　　7通過Western blot的方法檢測shRNA干擾Skp2表達(dá)對前列腺癌紫杉醇耐

5、藥細(xì)胞PC-3-TxR和DU145-TxR的Skp2細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinA、CyclinB1、CyclinE2、p21、 p27和FOXO1表達(dá)的影響。探討Skp2參與前列腺癌紫杉醇耐藥形成的可能相關(guān)的信號通路和分子機(jī)制。
　　8應(yīng)用MTS方法檢測Skp2抑制劑C1（SKPin C1)和SZL-P1-41（復(fù)合物＃25）對前列腺癌親本細(xì)胞PC-3和DU145和紫杉醇耐藥細(xì)胞PC-3-TxR和DU145-TxR增殖和活力的影

6、響。
　　9利用Western blot方法檢測Skp2抑制劑C1（SKPin C1)和SZL-P1-41（復(fù)合物#25）聯(lián)合紫杉醇作用對前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞PC-3-TxR和DU145-TxR Skp2重要的底物蛋白P21、P27表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　通過MTS實驗觀察發(fā)現(xiàn)12.5nM紫杉醇處理48或72小時顯著抑制PC-3細(xì)胞生長；而在PC-3-TxR細(xì)胞，200nM紫杉醇處理48或72小時才顯著抑制細(xì)胞

7、的生長。親本細(xì)胞PC-3或DU145的72小時IC50分別是18.42或10.91nM。耐藥細(xì)胞PC-3-TxR或DU145-TxR的72小時IC50分別是
　　166.47或3245.63nM。Western blot方法和實時熒光定量RT-PCR的實驗觀察發(fā)現(xiàn)Skp2蛋白和mRNA在前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞表達(dá)顯著增加。在紫杉醇耐藥的前列腺癌細(xì)胞里構(gòu)建篩選穩(wěn)定的干擾Skp2的細(xì)胞株P(guān)C-3-TxR Skp2shRNA和DU145

8、-TxR Skp2shRNA。耐藥細(xì)胞干擾Skp2之后增加了對紫杉醇的敏感性。Skp2抑制劑與紫杉醇聯(lián)合用藥的MTS結(jié)果表明，紫杉醇組與紫杉醇聯(lián)合Skp2抑制劑組相比，紫杉醇聯(lián)合Skp2抑制劑組的細(xì)胞增殖抑制作用更加明顯，Western blotting實驗觀察到上皮細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志E-cadherin在耐藥細(xì)胞株中顯著低于親本細(xì)胞株；間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志Vimentin和Skp2在耐藥細(xì)胞株中顯著高于親本細(xì)胞株。與親本細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株

9、中Skp2的底物蛋白p27的表達(dá)降低。免疫熒光技術(shù)進(jìn)一步觀察EMT的標(biāo)志物和Skp2的表達(dá)和定位。在紫杉醇耐藥的前列腺癌細(xì)胞里敲低Skp2之后恢復(fù)了p27的表達(dá)。此外，在耐藥細(xì)胞株中紫杉醇和Skp2抑制劑單獨處理導(dǎo)致了p27的累積。重要的發(fā)現(xiàn)是紫杉醇聯(lián)合Skp2抑制劑之后顯著地增加了p27的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　研究發(fā)現(xiàn)Skp2在前列腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞高表達(dá)；敲低Skp2表達(dá)能增加前列腺癌耐藥細(xì)胞對紫杉醇的敏感性，逆轉(zhuǎn)p2