母體邊緣性碘缺乏對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘和樹突發(fā)育的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過在孕期和哺乳期用缺碘飲食喂養(yǎng)母鼠建立邊緣性碘缺乏模型，探討母體邊緣性碘缺乏是否會(huì)影響子代海馬細(xì)胞骨架的構(gòu)建，從而造成錐體神經(jīng)元樹突和樹突棘發(fā)育障礙，引起子代長時(shí)程突觸可塑性損傷。以期從形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)角度闡明孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對(duì)仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)育及長時(shí)程突觸可塑性的影響和相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組
　　健康雌性Wistar大鼠(130-150 g)，按

2、體重隨機(jī)分成三組:對(duì)照組、邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組，各組均飼以缺碘地區(qū)糧食配制的飼料，飲用加入不同濃度碘化鉀(potassium iodide，KI)的去離子水，各組雌鼠日碘攝入量分別為:7.0μg/d、5.0μg/d和1.5 tg/d。雌鼠飼養(yǎng)三個(gè)月后，與正常雄鼠交配妊娠。各組取孕鼠20-22只，于母鼠妊娠0天(gestational day，GD0)，GD13和GD19時(shí)用代謝籠收集母鼠尿液用于測定尿碘濃度(urinary io

3、dine concentration，UIC)。GD0開始直至仔鼠生后21天(postnatal day，PN21)，對(duì)照組、邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組飲食同前。PN21仔鼠斷乳后，各組均以普通飼料和自來水喂養(yǎng)。
　　二、大鼠甲狀腺重及仔鼠海馬重的記錄
　　在母鼠GD19和PN21時(shí)間點(diǎn)以及仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，取雙側(cè)甲狀腺組織稱重并記錄。并于取材時(shí)記錄各時(shí)間點(diǎn)仔鼠海馬重。
　　三、大鼠血清TH

4、及TSH水平測定
　　分別于母鼠GD0，GD19和PN21，仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，心臟采血，靜置30 min后3000rpm離心10 min，分離血清。采用固相化學(xué)免疫發(fā)光法測定血清中游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)T4）、總甲狀腺素(total thyroxine，TT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）和促甲狀腺激素(thyroidstimulat

5、ing hormone，TSH)水平。
　　四、仔鼠海馬長時(shí)程突觸可塑性的測定
　　在PN70-80天期間，用烏拉坦麻醉仔鼠后，固定在立體定位儀上，將刺激電極插入海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞層;記錄電極則插入海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層。作基線記錄30 min后，給予100Hz的高頻刺激。記錄并分析刺激前后群峰電位(population spike，PS)幅值和興奮性突觸后電位(field-excitatory postsynapticp

6、otential，f-EPSP)斜率變化。
　　五、仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突棘發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)各組取4只仔鼠，快速分離新鮮腦組織。Golgi-Cox染色后觀察仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘的發(fā)育情況。統(tǒng)計(jì)每只動(dòng)物CA1區(qū)錐體神經(jīng)元頂樹突分支上的樹突棘個(gè)數(shù)，樹突棘密度表示為每10μm單位長度樹突棘的個(gè)數(shù)。并且統(tǒng)計(jì)分析四種不同形態(tài)樹突棘的頻數(shù)。
　　六、仔鼠海馬神經(jīng)元樹

7、突棘發(fā)育相關(guān)蛋白的測定分析
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，每組選取6只仔鼠，斷頭取腦，分離海馬組織。用超速離心的方法分離G-actin與F-actin后分別測定其表達(dá)水平，并分析各組G-actin/F-actin的值。采用Western Blot方法分別測定海馬中PAK1/2/3、LIMK1、cofilin及其磷酸化蛋白和drebrin蛋白的表達(dá)水平。并通過Pull-down的方法，測定各組各時(shí)間點(diǎn)海馬中Rac

8、l蛋白活性。全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)照相，用分析軟件測得各條帶的凈光密度值。
　　七、仔鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元樹突發(fā)育的形態(tài)學(xué)研究
　　分別于PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)各組取4只仔鼠，分離新鮮腦組織。Golgi-Cox染色后觀察仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支的發(fā)育情況。用ImageJ軟件分別測量各組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元基樹突和頂樹突分支總長度并用Sholl分析方法分析樹突分支復(fù)雜性。
　　結(jié)果：
　　一、孕

9、期和哺乳期邊緣性碘缺乏不影響大鼠甲狀腺重和仔鼠海馬重
　　在母鼠GD19和PN21以及仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，取雙側(cè)甲狀腺組織稱重，結(jié)果顯示孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對(duì)母鼠和仔鼠的甲狀腺重沒有影響;與對(duì)照組和邊緣性碘缺乏組相比，重度碘缺乏組大鼠甲狀腺重明顯增加(P＜0.05)。在仔鼠出生后的各時(shí)間點(diǎn)取海馬組織稱重，發(fā)現(xiàn)孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對(duì)仔鼠海馬重亦沒有影響，兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

10、>　　二、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏導(dǎo)致大鼠血清T4水平及尿碘濃度輕微下降
　　在母鼠GD0，GD19和PN21，仔鼠PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，邊緣性碘缺乏組和對(duì)照組FT3和TSH水平與對(duì)照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時(shí)間點(diǎn)，邊緣性碘缺乏組的TT4水平均低于對(duì)照組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在母鼠PN21，仔鼠PN21和PN28時(shí)，邊緣性碘缺乏組FT4水平顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)。其他各時(shí)

11、間點(diǎn)，對(duì)照組與邊緣性碘缺乏組FT4水平無明顯差異。在各時(shí)間點(diǎn)時(shí)，重度碘缺乏組母鼠和仔鼠的FT3、FT4和TT4水平均顯著低于對(duì)照組，TSH水平顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。
　　尿碘濃度測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組母鼠尿碘濃度較對(duì)照組輕微下降。而重度碘缺乏組母鼠尿碘濃度與對(duì)照組和邊緣性碘缺乏組相比顯著降低(P＜0.05)。
　　三、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏損傷仔鼠海馬CA1區(qū)LTP
　　PN70-80時(shí)

12、，高頻刺激后邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)f-EPSP斜率和PS幅值增加較對(duì)照組低(P＜0.05);與對(duì)照組和邊緣性碘缺乏組相比，重度碘缺乏組f-EPSP斜率和PS幅值增加顯著降低(P＜0.05)。
　　四、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘的發(fā)育
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜

13、0.05)。重度碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞樹突棘密度顯著低于邊緣性碘缺乏組(P＜0.05)。此外，與對(duì)照組比，在重度碘缺乏組中不成熟的樹突棘數(shù)目較多而成熟樹突棘則較少。邊緣性碘缺乏組與對(duì)照組相比，各類型樹突棘的比例沒有明顯差異（P＞0.05）。
　　五、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬中PAKs/LIMK1/cofilin信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，邊緣性碘缺乏組和重度碘

14、缺乏組仔鼠海馬中G-actin/F-actin值較對(duì)照組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);在各時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬p-PAK1/2、p-LIMK1、p-cofilin蛋白表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)，在PN14、PN21和PN28時(shí)，邊緣性碘缺乏組drebrin蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組降低（P＜0.05）。在各時(shí)間點(diǎn)，重度碘缺乏組仔鼠海馬p-PAK1/2、p-LIMK1、p-cofilin和drebri

15、n蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和邊緣性碘缺乏組均顯著降低(P＜0.05)。
　　六、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬中Rac1蛋白活性
　　在PN7、PN14、PN21和PN28時(shí)，各組之間總Rac1蛋白表達(dá)沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬Rac1活性下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);重度碘缺乏組仔鼠海馬Rac1活性較對(duì)照組和邊緣性碘缺乏組顯著降低(P＜0.05)。
　

16、　七、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏影響仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突分支的發(fā)育
　　在PN7、PN14和PN21時(shí)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組仔鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞基樹突分支總長度顯著下降（P＜0.05）;PN28時(shí)，基樹突分支總長度與對(duì)照組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。在各時(shí)間點(diǎn)，邊緣性碘缺乏組和對(duì)照組頂樹突總長度沒有明顯差異(P＞0.05)。重度碘缺乏組錐體細(xì)胞基樹突和項(xiàng)樹突分支總長度均顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

17、＜0.05)。與對(duì)照組比較，在PN14、PN21和PN28時(shí)，邊緣性碘缺乏組基樹突分支與同心圓的交點(diǎn)數(shù)稍有下降，而重度碘缺乏組有明顯下降。且Sholl分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，邊緣性碘缺乏組和重度碘缺乏組頂樹突分支復(fù)雜性沒有明顯改變。
　　結(jié)論：
　　1、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏對(duì)仔鼠海馬長時(shí)程突觸可塑性造成輕度損傷。
　　2、孕期和哺乳期邊緣性碘缺乏使仔鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元樹突棘密度下降，其機(jī)制可能是影響海馬P