雄激素對原代海馬神經(jīng)元樹突棘及突觸蛋白的快速作用.pdf

1、目的：以原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元為研究對象，觀察睪酮（T）、雙氫睪酮（DHT）和睪酮-牛血清白蛋白（T-BSA）對原代海馬神經(jīng)元樹突棘的密度和形態(tài)以及突觸蛋白PSD95和SYN的快速作用，探討雄激素非基因組效應(yīng)對海馬神經(jīng)元突觸形態(tài)可塑性的影響。
　　方法：
　　1.基于樹突棘形態(tài)學(xué)觀察的大鼠原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染GFP方法的優(yōu)化。選用孕18 d的SD大鼠，解剖胎鼠腦組織，分離海馬，進行海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)。應(yīng)用Lipofectami

2、ne2000和慢病毒兩種轉(zhuǎn)染方法對體外培養(yǎng)8 d的SD大鼠海馬神經(jīng)元進行綠色熒光蛋白GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，觀察海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染效率和熒光表達情況，并用臺盼藍染色檢測神經(jīng)元的存活率；之后，采用優(yōu)選出的轉(zhuǎn)染方法對體外培養(yǎng)8d的海馬神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至10 d、15 d、20 d和25 d不同時間海馬神經(jīng)元樹突棘的生長發(fā)育情況；最后，觀察8 d、12 d和16 d不同時間轉(zhuǎn)染對海馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)的影響。
　　2.雄激素對大鼠原代海

3、馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。選取優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方法 Lipofectamine2000對海馬神經(jīng)元進行GFP轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)至第20 d時，利用共聚焦顯微鏡和活細(xì)胞工作站對轉(zhuǎn)染成功且狀態(tài)良好的海馬神經(jīng)元樹突棘進行活細(xì)胞成像觀察。實驗隨機分為4組：對照組（Con組）、T組、DHT組和T-BSA組。根據(jù)參考文獻和預(yù)實驗結(jié)果， T組和DHT組藥物作用濃度為10 nM， T-BSA組為0.36 nM，Con組給予

4、等量的二甲基亞砜。利用激光共聚焦顯微鏡觀察藥物干預(yù)前后樹突棘的形態(tài)變化并記錄樹突棘的密度和表面積。每隔30 min掃描拍照一次，共觀察120 min。
　　3.雄激素對大鼠原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。大鼠原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)。培養(yǎng)至第20 d時，進行實驗。實驗分組和藥物作用濃度同上一部分。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，藥物作用時間為60 min。給藥結(jié)束后，應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞染色方法，激光共聚焦顯微鏡對突觸蛋白PSD95

5、和SYN進行觀察。
　　結(jié)果：
　　1.基于樹突棘形態(tài)學(xué)觀察的大鼠原代海馬神經(jīng)元轉(zhuǎn)染GFP方法的優(yōu)化。對于樹突棘形態(tài)學(xué)觀察而言，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于慢病毒，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染效率為5.21％，低于慢病毒轉(zhuǎn)染效率82.53%。但就轉(zhuǎn)染前后神經(jīng)元存活率而言，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染后24 h存活率為93.78%，高于慢病毒轉(zhuǎn)染后24 h存活率83.37%。轉(zhuǎn)染1 w后，

6、 Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染存活率為91.59%，顯著高于慢病毒轉(zhuǎn)染存活率72.92%；且Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染成功的神經(jīng)元生長狀態(tài)也優(yōu)于慢病毒轉(zhuǎn)染組。海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至20 d時，樹突棘發(fā)育較成熟，絲狀偽足明顯減少，形成密集的短粗狀或蘑菇狀的樹突棘。12 d時進行轉(zhuǎn)染是進行樹突棘形態(tài)學(xué)觀察的最佳轉(zhuǎn)染時間；細(xì)胞培養(yǎng)至20 d時熒光表達較好，樹突棘形態(tài)清晰可見，適合進行活細(xì)胞樹突棘長時間形態(tài)學(xué)觀察。
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7、.雄激素對大鼠原代海馬神經(jīng)元樹突棘形態(tài)以及密度和表面積的快速影響。
　　樹突棘形態(tài)：各組樹突棘形態(tài)多樣，蘑菇狀、短粗狀、細(xì)桿狀等各種形狀的樹突棘可以在同一時間的同一樹突上被發(fā)現(xiàn)，而且樹突棘的形態(tài)不是固定不變的。在觀察的時間內(nèi)，樹突棘的形態(tài)不是固定不變的。各組相比，Con組的樹突棘形態(tài)相對穩(wěn)定，沒有明顯的變化。其它三組給藥后，一些樹突棘形態(tài)有了較明顯的變化，更趨于成熟，表現(xiàn)為由細(xì)桿型變成短粗型或者由短粗型變成蘑菇型。
　　樹突

8、棘密度：在120 min的觀察時間內(nèi)，Con組、T組、DHT組和T-BSA組樹突棘密度變化無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　樹突棘表面積：Con組樹突棘的表面積隨著時間的改變，相對穩(wěn)定變化不大。T組、DHT組和T-BSA組樹突棘的表面積隨著時間的改變，呈現(xiàn)一定的變化。在60 min時，與Con組（1.27±0.41）相比，T組（2.47±0.64）、DHT組（2.68±1.08）和T-BSA組（2.61±0.67）樹突棘表面積變化差異有統(tǒng)計學(xué)意

9、義。在90 min時，與Con組（1.41±0.31）相比，T組（2.41±0.52）、DHT組（2.58±0.80）和T-BSA組（2.38±0.60）樹突棘表面積變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其中，給藥60 min時，差異最顯著。其余各時間段差異無統(tǒng)計學(xué)意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間樹突棘表面積變化無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.雄激素對大鼠原代海馬神經(jīng)元突觸蛋白 PSD95和 SYN的快速影響。
　　PSD95免疫熒光細(xì)胞

10、化學(xué)染色結(jié)果顯示：與Con組（63.60±2.06）相比，T組（90.78±2.83）、DHT組（85.48±2.41）和T-BSA組（88.42±3.40）突觸蛋白PSD95的熒光強度都有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。T組、DHT組和T-BSA組三組之間PSD95熒光強度無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　SYN免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示：與Con組（52.96±0.97）相比， T組（63.02±0.66）、DHT組（65.00±1.46）和T

11、-BSA組（63.47±1.05）突觸蛋白SYN的熒光強度都有所增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。T組、DHT組和 T-BSA組三組之間 SYN熒光強度無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.基于樹突棘形態(tài)學(xué)觀察的目的，用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染GFP方法對培養(yǎng)12 d的原代海馬神經(jīng)元進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至20 d時進行樹突棘形態(tài)學(xué)觀察效果良好。
　　2.雄激素在短時間內(nèi)未能增加大鼠原代海馬神經(jīng)元樹突棘密度，但影響了樹突棘形