CRMP4與微絲相互作用介導(dǎo)海馬神經(jīng)元突起生長和樹突棘形成的研究.pdf

1、目的：
　　探討CRMP4是否能與微絲發(fā)生相互作用并明確結(jié)合部位，以及如何影響神經(jīng)元的軸突、樹突及樹突棘發(fā)育。
　　方法：
　　首先構(gòu)建GST-CRMP4及其截短片段原核質(zhì)粒，然后進行體外表達其融合蛋白，利用pull-down實驗分析CRMP4與微絲的結(jié)合部位；最后構(gòu)建CRMP4及其截短片段的真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，觀察CRMP4與微絲結(jié)合后對神經(jīng)元突起生長及樹突棘形成的作用。
　　結(jié)果：
　

2、?。?）構(gòu)建重組原核質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示，酶切條帶大小與預(yù)期的相符，CRMP4的截短片段GST-CRMP4ΔN323、GST-CRMP4ΔC471測序結(jié)果與預(yù)期的序列完全吻合，無突變發(fā)生；
　　（2）原核表達系統(tǒng)表達相應(yīng)的CRMP4及其截短片段質(zhì)粒的融合蛋白，融合蛋白分子量分別為90.7kDa、53kDa、77kDa，與預(yù)期大小一致；
　　（3）用體外表達的CRMP4及其截短片段質(zhì)粒的與腦組織蛋白提取液進行的pull down實

3、驗，結(jié)果顯示，GST-CRMP4、GST-CRMP4ΔN323可以成功層析出肌動蛋白；
　?。?）構(gòu)建重組真核質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示，酶切條帶大小與預(yù)期的相符，CRMP4的截短片段CRMP4ΔN323、CRMP4ΔC471測序結(jié)果與預(yù)期的序列完全吻合，無突變發(fā)生
　?。?）將構(gòu)建成功的CRMP4及其截短質(zhì)粒和對應(yīng)的空載體使用鈣磷轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染至原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，然后通過免疫細胞化學(xué)來觀察發(fā)現(xiàn)CRMP4與微絲結(jié)合后可以促進神經(jīng)元突起

4、生長及樹突棘形成。
　　結(jié)論：
　?。?）成功構(gòu)建了CRMP4截短片段的原核和真核表達載體；
　?。?）體外成功表達了GST-CRMP4及其截短片段的融合蛋白；
　?。?）GST-CRMP4、GST-CRMP4△N323與微絲蛋白結(jié)合，但GST-CRMP4△C471不與微絲蛋白結(jié)合，說明CRMP4與微絲的結(jié)合位點位于C末端的471-570氨基酸中；
　?。?）真核質(zhì)粒CRMP4和CRMP4△N323通過微絲