人精漿中睪丸來源環(huán)狀RNA的存在及特點研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:人睪丸組織中環(huán)狀RNA的測序與鑒定
　　背景及目的：非編碼RNA作為表觀遺傳調(diào)控的重要執(zhí)行者之一，成為了基因表達轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平重要的調(diào)控因素。circRNA作為一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA成為了近期轉(zhuǎn)錄物組研究的明星分子之一。基因表達及其表觀遺傳調(diào)控在精子發(fā)生中起到了至關(guān)重要的作用，其異常可能與不育及后代健康緊密相關(guān)。本部分我們對人睪丸組織中這一類新型內(nèi)源性非編碼RNA進行了初步

2、的探索，為完善人睪丸組織非編碼RNA種類，及研究其在精子發(fā)生中的可能作用及機制提供依據(jù)與基礎(chǔ)。
　　方法：Trizol法提取精子發(fā)生正常人睪丸組織總RNA，去除核糖體RNA，使用RNaseR消化所有線性RNA后，構(gòu)建cDNA文庫，采用Illumina HiSeq3000測序平臺，PE150測序模式進行高通量深度測序。測序結(jié)果中選取表達豐富（count值）不一、長度大小各異的 circRNA，根據(jù)所預測的序列起始位點及成環(huán)特點，使用

3、 NCBI/Primer-BLAST在線設(shè)計Divergent Primer進行qRT-PCR驗證及circRNA可變環(huán)化（alternative circularization）特性分析。使用RNaseR消化處理睪丸組織RNA，qRT-PCR檢測基因?qū)腸ircRNA及mRNA在消化前后表達量變化。
　　結(jié)果：在人睪丸組織中測序reads的 count值大于等于1的circRNA共計15996條，其中10792條為數(shù)據(jù)庫cir

4、cBase至目前未收錄的，為本次測序中新預測的circRNA。產(chǎn)生這15996條circRNA的宿主基因中，94.6％只能產(chǎn)生6個及6個以內(nèi)的circRNA。有1017個宿主基因是本次測序中發(fā)現(xiàn)可以成環(huán)的，且主要與精子發(fā)生、精子結(jié)構(gòu)及精子功能等密切相關(guān)。同時構(gòu)成這15996條circRNA的序列70.6%為基因組中外顯子序列。隨機選取的55個circRNA中，有22個是數(shù)據(jù)庫circBase中存在的circRNA，33個是本次測序預測的

5、新circRNA。其中有30個能特異性的被擴增檢測，包括19個數(shù)據(jù)庫circBase中存在的circRNA和11個本次測序中新預測的circRNA；有9個能被擴增檢測但同時含有其他bp大小的條帶非特異性擴增，包括3個數(shù)據(jù)庫circBase中存在的circRNA和6個本次測序中新預測的circRNA。而成功特異性驗證的30個circRNA包含了11個普遍表達基因的16個circRNA和11個睪丸特異性基因的14個circRNA。
　

6、　選取其中3個基因(STK31、RNF17、SAE1)所對應的circRNA設(shè)計引物，成功的分析了環(huán)狀RNA可變環(huán)化特性。對9個基因所對應的circRNA及mRNA進行RNase R消化處理后，同一個基因的mRNA表達量顯著性降低，而circRNA表達量未見明顯降低，反而個別基因（如HIST1H2BA、WDR26、TBL1XR1）的circRNA表達量顯著上調(diào)約4倍，顯示了circRNA高效的耐RNase R消化特性。
　　結(jié)論：

7、本研究在人睪丸組織中成功的預測和鑒定了circRNA的存在，新發(fā)現(xiàn)了10000多條circRNA及1000多個可以成環(huán)的宿主基因。且這些睪丸來源的circRNA具有可變環(huán)化特性及耐RNase R消化特性。這些circRNA有望成為新的男性精子發(fā)生表觀遺傳研究點。
　　第二部分:人睪丸來源環(huán)狀RNA在精漿中的表達與特征
　　背景及目的：精漿中存在豐富的游離mRNA及游離miRNA，穩(wěn)定性好，獲取方便，能全面代表各生殖器官組織（

8、睪丸、附睪、精囊腺、前列腺等）的基因表達信息，是潛在的男性生殖疾病無創(chuàng)性新分子診斷標記物，也是很好的生殖遺傳表觀遺傳研究指標。對于新近報道的circRNA，本部分實驗以第一部分已經(jīng)驗證在人睪丸組織中表達的circRNA為研究對象，分析其在精漿中的表達情況及基本特征，從而探索精漿游離circRNA可能的研究前景。
　　方法：收集精液參數(shù)正常男性的精液標本，分離精漿，提取RNA，qRT-PCR分析第一部分成功驗證的circRNA是否在

9、精漿中表達。將精漿在室溫條件下放置0h、12h、24h后，檢測circRNA的表達量變化，探索精漿中circRNA的穩(wěn)定性。將孔徑0.1um濾膜過濾與30kDa超濾離心柱超濾相結(jié)合，對未處理精漿、濾膜過濾后的濾液及濾膜洗脫液、上述濾膜過濾液再經(jīng)30kDa超率離心柱離心過濾的濾液及超濾膜洗脫液中circRNA含量進行檢測，分析其可能的存在形式。
　　結(jié)果：選取第一部分成功驗證中的20個睪丸來源的circRNA，無論是普遍表達基因的c

10、ircRNA，還是睪丸特異性表達基因的circRNA，都能在精漿中檢測出來。室溫條件下精漿放置0h、12h、24h后，circRNA的表達量沒有明顯的差異，顯示了睪丸來源circRNA在精漿中具有很好的穩(wěn)定性。0.1um濾膜過濾與30kDa超濾離心柱超濾相結(jié)合過濾實驗中,circRNA大部分存在于0.1um濾膜過濾后的濾液中，而將這一濾液再次經(jīng)超濾離心柱過濾后，大部分circRNA被超濾膜截留在樣品濃縮管中。表明精漿中游離的circRN