原發(fā)性肝癌圍手術(shù)期肝移植患者外周血環(huán)狀RNA的差異表達(dá)研究.pdf

1、肝臟是身體內(nèi)極其重要的代謝器官，其功能的失調(diào)會(huì)影響機(jī)體正常的新陳代謝和內(nèi)環(huán)境的變化。原發(fā)性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)是一類發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，一般由化學(xué)致癌物或環(huán)境因素引發(fā)的慢性肝病或肝硬化發(fā)展而來，但是目前發(fā)病機(jī)制還未闡明，病理診斷和治療手段有一定的局限性。同種異體肝移植是目前治療PLC最徹底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是醫(yī)療界所面臨的問題。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)用于PLC早期診斷以

2、及治療作用評(píng)估的新生物標(biāo)記物。
　　近年來，隨著分子生物學(xué)基因芯片技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者利用該技術(shù)探索了各類生物小分子與疾病的關(guān)系，而環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是目前研究重大疾病分子機(jī)理的熱點(diǎn)。circRNA是一類保守性好、特異性高，對(duì)靶基因能發(fā)揮調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA，利用circRNA微陣列芯片技術(shù)，對(duì)circRNA進(jìn)行表達(dá)譜的構(gòu)建，篩選出具有差異表達(dá)的circRNA作為疾病相關(guān)的生物標(biāo)

3、志物，并對(duì)其進(jìn)行功能研究，可以使我們更好地了解疾病發(fā)生的分子機(jī)制，進(jìn)而提高相關(guān)疾病的預(yù)防和診斷水平。
　　目的:利用circRNA微陣列芯片分析圍手術(shù)期PLC肝移植患者和健康對(duì)照者外周血circRNA表達(dá)譜，通過比較未實(shí)施肝移植術(shù)前患者與實(shí)施肝移植術(shù)后患者、健康對(duì)照者之間差異性表達(dá)的circRNA，篩查PLC特異表達(dá)的circRNA以及移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)相關(guān)的circRNA，為PLC早期診斷、預(yù)后以及治療提供新的信息。

4、　　方法:收集2014年12月1日至2015年8月31日于中國人民解放軍第一八一醫(yī)院確診為PLC并進(jìn)行肝移植手術(shù)，且治療效果較好的4例患者的臨床資料及外周血標(biāo)本，其中患者外周血標(biāo)本分為術(shù)前組（采集于PLC患者肝移植術(shù)前1天）、術(shù)后組（采集于患者肝移植術(shù)后1天、術(shù)后3天、術(shù)后7天）。健康對(duì)照組4例外周血標(biāo)本采集于與PLC患者年齡、性別和民族等匹配的健康人群。利用Trizol法提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000檢測(cè)RNA是否

5、降解并測(cè)定RNA濃度;采用circRNA微陣列芯片分析PLC患者肝移植圍手術(shù)期和健康對(duì)照者circRNA表達(dá)譜。對(duì)肝移植術(shù)前組、術(shù)后組以及健康對(duì)照組表達(dá)的circRNA進(jìn)行組間差異比較，篩選出與PLC特異表達(dá)以及移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)相關(guān)的circRNA。最后，應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證circRNA微陣列芯片分析的準(zhǔn)確性，并利用miRNA靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)與miRNA吸附相關(guān)的circRNA，分析circRNA的功能。
　　結(jié)果

6、:(1)在肝移植術(shù)前與術(shù)后自身對(duì)照比較研究中，PLC患者肝移植術(shù)后組（術(shù)后1天、3天、7天）circRNA歸一化均值/PLC患者肝移植術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0（fold change≥2.0）的circRNA有120個(gè)，說明這120個(gè)circRNA在肝移植術(shù)后組中上調(diào)表達(dá)。PLC患者肝移植術(shù)后組（術(shù)后1天、3天、7天）circRNA歸一化均值/PLC患者肝移植術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0(fold change

7、≤-2.0)的circRNA有182個(gè)，說明這182個(gè)circRNA在肝移植術(shù)后組中下調(diào)表達(dá)。
　　(2)在PLC肝移植術(shù)前、術(shù)后分別與健康對(duì)照組比較研究中，術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值/健康對(duì)照組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0∩術(shù)后組circRNA歸一化均值/術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0的circRNA有165個(gè);術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值/健康對(duì)照組circRNA歸一化數(shù)值≤-2.0∩術(shù)后組circRNA歸

8、一化均值/術(shù)前組circRNA歸一化數(shù)值≥2.0的circRNA有80個(gè)。
　　(3)165個(gè)circRNA在機(jī)體存在腫瘤時(shí)表達(dá)上調(diào)，實(shí)施PLC肝切除及肝移植術(shù)后表達(dá)下調(diào)，可能是與PLC相關(guān)生物標(biāo)記物，miRNA靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)其中的hsa_circRNA_102347與miR-203存在相互作用位點(diǎn)，且已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-203為肝癌特異性表達(dá)miRNA。而80個(gè)circRNA在機(jī)體存在腫瘤時(shí)表達(dá)下調(diào)，實(shí)施PLC肝切

9、除及肝移植術(shù)后表達(dá)上調(diào)，推測(cè)其可能與肝移植術(shù)后早期肝功能恢復(fù)有關(guān)，miRNA靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)其中的hsa_circRNA_400031與miR-483-5p存在相互作用位點(diǎn)，且已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-483-5p與肝癌發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系。
　　(4) RT-PCR驗(yàn)證表明 hsa_circRNA_400031、 hsa_ circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102

10、347的表達(dá)情況與芯片分析結(jié)果基本一致。此外， RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn) hsa_circRNA_102032、 hsa_ circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植術(shù)前組的表達(dá)量相對(duì)于健康對(duì)照組極其顯著上調(diào)(p＜0.01)，并且在肝移植術(shù)后1天、3天、7天有著顯著下調(diào)的趨勢(shì)，可能是機(jī)體PLC切除及肝移植預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物。
　　結(jié)論:(1) PLC患者實(shí)施肝摘除和肝移植前后存在大量差異表達(dá)circR