蓽撥寧對大鼠重癥急性胰腺炎的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)為臨床常見危重疾病。盡管臨床對急性腺炎的診療水平不斷提高，但重癥急性胰腺炎(Severe acutepancreatitis。SAP)的死亡率仍高達(dá)10％-30%。SAP時，大量炎癥細(xì)胞被過度激活并釋放白介素-1、6、10（Interleukin-1、6、10,IL-1、6、10）等炎癥因子，從而啟動全身炎癥反應(yīng)和調(diào)控胰腺組織細(xì)胞凋亡。因此在SAP早期控制炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，能大大

2、減輕胰腺損傷，提高患者的生存率和改善預(yù)后。近年研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥蓽茇根部提取物蓽撥寧(piperlonguminine,PL)通過影響活性氧簇（Reactive oxygen specie s,ROS）、部分凝血活酶時間和ERK-1/2信號通路等，在修復(fù)腦神經(jīng)損傷、抗凝血活性和抑制腫瘤細(xì)胞生長等方面均有調(diào)控作用。本課題旨在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，進(jìn)行中醫(yī)藥治療SAP機(jī)理及其分子基礎(chǔ)的研究，尤其是探討中藥新藥－蓽撥寧治療

3、SAP的作用靶點(diǎn)及其可能的相關(guān)分子機(jī)制，為今后開發(fā)新的中醫(yī)藥治療SAP提供理論依據(jù)。
　　目的：
　　建立SAP大鼠模型，探討中藥蓽撥根部提取物蓽撥寧單體對SAP大鼠的作用及其相關(guān)分子機(jī)制，為進(jìn)一步開發(fā)該蓽撥寧提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.動物的分組與處理
　　1.1.動物模型的分組：60只SD大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)（SO）組（10只），模型（SAP）組（10只），蓽茇寧（P）組（30只），甲磺

4、酸加貝酯（GM）組（10只）。
　　1.2動物分組后處理：采用逆行胰膽管注射5%牛黃膽酸鈉(0.1ml/100g)建立SAP大鼠模型。SO組以生理鹽水代替5%牛黃膽酸鈉。P組于建模后隨機(jī)分成低、中、高劑量組（2.5，5，10mg.kg-1）并立即將蓽茇寧以腹腔注射形式給藥SAP大鼠。GM組建模后立即將甲磺酸加貝酯（gabexate mesilate,GM）（10mg.kg-1）以腹腔注射形式給藥SAP大鼠。而SO組和SAP組用等量

5、的生理鹽水以腹腔注射形
　　式注入大鼠。12h后處死大鼠留取血清及胰腺組織標(biāo)本。
　　2.實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)
　　2.1.第一部分實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：12h后觀察大鼠術(shù)后一般狀態(tài)。隨后處死大鼠留取部分胰腺組織干燥箱烤至恒重后檢測干濕比重。觀察胰腺頭部組織病理學(xué)大體改變及HE染色鏡下觀改變。紫外分光光度計檢測：大鼠血清淀粉酶（Amylase。AMS）、脂肪酶（Lipase。LPS）變化。
　　2.2.第二部分實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：紫外

6、分光光度計檢測：大鼠血清髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）變化。ELISA法檢測：大鼠血清干擾素-γ（Interferon-γ,I FN-γ）、白介素-1（Interferon-1β，IL-1β）、白介素-10（Interferon-10，IL-10）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α。TNF-α）變化。定量PCR檢測：胰腺組織TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA變化。蛋白質(zhì)印跡法檢

7、測：胰腺組織TLR-4蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)量變化。
　　2.3.第三部分實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：TUNNEL染色檢測：大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡情況。定量PCR檢測：peroxiredoxin-4 mRNA、XBP-1 mRNA和p38MAPmRNA表達(dá)量變化。蛋白質(zhì)印跡法檢測：peroxiredoxin-4蛋白表達(dá)量變化。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1.1.第一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）總體上SO組大鼠一般狀

8、態(tài)良好，SAP組大鼠狀態(tài)萎靡，P組及GM組大鼠狀態(tài)較SAP組好轉(zhuǎn)。
　　（2）SAP組大鼠血清AMS和LPS值較SO組升高3倍以上。P組、GM組AMS和LPS水平較SAP組下降（P＞0.05）。
　?。?）SAP組大鼠胰腺組織干濕比重值較SO組明顯升高（P＜0.05）。P組和GM組大鼠胰腺組織干濕比重值較SAP組下降（P＜0.05）。
　?。?）病理切片大體及鏡下結(jié)果顯示，SAP組大鼠胰腺損傷較SO組嚴(yán)重。P組和GM組

9、大鼠胰腺損傷較SAP組減輕。
　　1.2.第二部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）MPO水平結(jié)果顯示：SAP組大鼠血清MPO表達(dá)水平較SO組明顯升高（P＜0.05），P組、GM組較SAP組有下降趨勢，但差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　?。?）ELISA結(jié)果顯示：SAP組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平較SO組明顯升高（P＜0.05，0.01）。P組、GM組IL-1β、TNF-α和IFN-γ表達(dá)水平較S

10、AP組均顯著降低（P＜0.05，0.01）；雖SAP組的IL-10表達(dá)水平較SO組升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而P組、GM組IL-10表達(dá)水平較SAP組顯著升高（P＜0.05）。
　?。?）定量PCR結(jié)果顯示：SAP組大鼠胰腺TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA較SO組表達(dá)量明顯升高（P＜0.05，0.01）。P組、GM組胰腺組織TLR-4 mRNA和NF-κB mRNA表達(dá)量較SAP組顯著降低（P＜0.05）。<

11、br>　?。?）蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：SAP組大鼠胰腺T LR-4和NF-κB蛋白表達(dá)量較SO組明顯升高。P組、GM組胰腺組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)量較SAP組顯著降低。
　　1.3.第三部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）TUNNEL染色結(jié)果顯示：SAP大鼠胰腺細(xì)胞凋亡程度較SO組增加。P組和GM組大鼠胰腺組織凋亡程度較SAP組增加。
　?。?）定量PCR結(jié)果顯示：SAP組大鼠胰腺peroxiredoxin-4 mRN

12、A、XBP-1 mRNA和p38MAPK mRNA表達(dá)量較SO組明顯升高（P＜0.05，0.01）。P組、GM組胰腺組織p38MAPK mRNA表達(dá)量較SAP組顯著升高（P＜0.05），XBP-1 mRN A表達(dá)量較SAP組有上升趨勢，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），peroxired oxin-4 mRNA蛋白表達(dá)量較SAP組顯著降低（P＜0.05）。
　　（3）蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：SAP組大鼠胰腺peroxiredox

13、in-4蛋白表達(dá)量較SO組明顯升高。P組、GM組胰腺組織peroxiredoxin-4蛋白表達(dá)量較SAP組顯著降低。
　　結(jié)論：
　　大鼠SAP模型建立成功。蓽撥寧能降低AMS、LPS的表達(dá)量，抑制SAP相關(guān)的炎癥因子(IL-1β、IL-10、TNF-α、IFN-γ)表達(dá)、具有緩解SAP病情的作用。其作用機(jī)制可能通過調(diào)節(jié)TLR-4/NF-κB通路和細(xì)胞凋亡，而減輕炎癥反應(yīng)。但其對SAP大鼠MPO參與的氧化應(yīng)激反應(yīng)及XBP-1