褪黑素對大鼠重癥急性胰腺炎腎臟損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的:觀察重癥急性胰腺炎大鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA),腎臟組織Livin蛋白和Caspase-9表達的變化,以探討褪黑素對重癥急性胰腺炎(SAP)相關(guān)腎臟損傷的保護作用及相關(guān)機制。
　　 方法:雌性SD大鼠90只,隨機分為正常對照組(NC組)(12H、24H、48H組分別各10只),模型組(SAP組)(12H、24H、48H組分別各10只),褪黑素組(MT組)(12H、24H、48H組分別各10只)。大鼠術(shù)

2、前12H禁食,自由飲水。3％的戊巴比妥鈉按40mg/kg婦的劑量經(jīng)腹腔注射麻醉。常規(guī)消毒,鋪巾,在無菌操作下做上腹正中切口3cm左右,打開腹腔,找到胃十二指腸交界處,再向下尋找到胰膽管十二指腸開口處。用絲線結(jié)扎(活結(jié))近肝門處胰膽管,用4.5號頭皮針于十二指腸乳頭附近經(jīng)十二指腸腸壁穿刺,逆行插入胰膽管,并在十二指腸乳頭處用手指捏住胰管末端。按1ml/kg將5％?；悄懰徕c逆行勻速推注至胰管中(0.2ml/min),使整個胰膽管均勻隆起。退

3、出針頭,即用手壓迫進針處約3～5min,然后去除結(jié)扎線,關(guān)腹,并同時開始計時觀察。正常對照組開腹后翻動腸壁即關(guān)腹。褪黑素組在術(shù)后10分鐘用褪黑素溶液于大鼠背部皮下注射3ml。褪黑素按照文獻數(shù)據(jù)選取大劑量(50mg/kg)。MT先被無水乙醇溶解,再用生理鹽水稀釋,使乙醇的終濃度為1％。模型組大鼠采用同樣方法給予等量的1％乙醇溶液。用全自動生化分析儀測定大鼠血清淀粉酶,肌酐(Cr),尿素氮(BUN)；用硫代巴比妥法測定MDA含量,黃嘌呤氧化

4、酶法測定SOD活力；免疫組化法檢測腎組織Livin和Caspase-9的表達；原位末端標記法(TUNEL)檢測腎臟細胞凋亡率。
　　 結(jié)果:1.胰腺的病理改變:正常對照組大鼠胰腺組織大體所見未見明顯病變。SAP造模組大鼠胰膽管逆行注入5％?；悄懰徕c后,胰管周圍胰腺組織顏色立即變紅,并逐漸擴展、加深。SAP造模12H后再次剖腹發(fā)現(xiàn)胰腺顏色紫暗,充血水腫明顯,可見局部壞死及出血,腹水明顯,呈淡紅色。褪黑素組大鼠12H后剖腹見胰腺顏色

5、變暗,充血水腫,但較模型組程度輕,未見明顯壞死、出血,有少量腹水。SAP造模24H后,剖腹可見腹腔內(nèi)大量淡紅色腹水,胰腺與周圍臟器粘連嚴重,表面可見多處出血點及壞死灶。褪黑素24H干預組剖腹觀察,大鼠腹腔內(nèi)可見腹水,胰腺與周圍組織輕度粘連,胰腺水腫,色澤紫暗,胰腺及網(wǎng)膜組織多處皂化斑。SAP造模48H后,剖腹可見腹腔內(nèi)大量血性腹水,胰腺與周圍臟器粘連嚴重,表面可見多處出血點、壞死灶及皂化斑。褪黑素48H干預組剖腹觀察,大鼠腹腔內(nèi)可見腹水

6、,腸管淤脹,胰腺與周圍組織輕度粘連,胰腺水腫,色澤紫暗,胰腺及網(wǎng)膜組織多處皂化斑。光鏡下觀察:正常組胰腺組織結(jié)構(gòu)完整,間質(zhì)無炎細胞浸潤。SAP模型12H組可見胰腺葉間隔、小葉間隙、腺泡間隔增寬及少量炎細胞浸潤；褪黑素12H干預組胰腺小葉間隙增寬、少量炎細胞浸潤,較胰腺炎組程度輕。SAP模型24H組時胰腺損傷較顯著,胰腺腺泡腫脹、出血、小葉內(nèi)和小葉外周局灶或片狀壞死,間質(zhì)可見較大量炎細胞浸潤、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失。褪黑素24H干預組胰腺間

7、質(zhì)疏松水腫,小葉小片狀壞死,間質(zhì)有炎細胞浸潤,小葉結(jié)構(gòu)相對清晰。SAP模型48H組時胰腺損傷已經(jīng)十分顯著,表現(xiàn)為胰腺腺泡極度腫脹、出血、小葉內(nèi)和小葉外周局灶或片狀壞死,間質(zhì)可見大量炎細胞浸潤、部分腺葉正常結(jié)構(gòu)消失。褪黑素48H干預組胰腺間質(zhì)疏松水腫,可見紅細胞滲出、小葉小片狀壞死,間質(zhì)有炎細胞浸潤,小葉結(jié)構(gòu)相對清晰。2.腎臟組織病理改變:正常對照組大鼠腎臟組織大體所見未見明顯病變。SAP模型組12H時腎臟外觀輕度水腫,呈暗紫色；24H時

8、腎臟充血水腫加重,并可見少量出血點。48H時腎臟充血水腫嚴重,并可見大量出血點。褪黑素干預組各時間點腎臟病理改變均較SAP組減輕。光鏡觀察結(jié)果:正常對照組未見異常。各時點腎皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰,腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)正常。SAP組12H時腎小球輕度腫脹,腎小管腫脹較為明顯,腎間質(zhì)見炎細胞浸潤；24H時腎小球、腎小管腫脹加重,腎小管上皮細胞可見壞死,腎間質(zhì)炎細胞增多。48H時腎小球、腎小管腫脹嚴重,腎小球可見淤血,腎小管上皮細胞可見壞死,腎間質(zhì)

9、大量炎細胞,可見管型。褪黑素干預組各時間點光鏡下所見病理改變均較SAP組減輕。3.生化指標:SAP造模組各時間點的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量較正常組各相應(yīng)時間點顯著升高(P<0.01)；SAP造模組各時間點的SOD活性較正常組各相應(yīng)時間點顯著降低(P<0.01)。與SAP造模組比較,褪黑素干預組各時間點的血清AMY、Cr、BUN及MDA含量顯著降低(P<0.05)；SOD活性顯著升高(P<0.01)。4.凋亡相關(guān)指標:SAP造

10、模組各時間點Livin蛋白陽性率較正常組各相應(yīng)時間點Livin蛋白陽性率降低(P<0.01),Caspase-9陽性率較正常組各相應(yīng)時間點升高(P<0.01)；與SAP造模組比較,褪黑素干預組各時間點Livin蛋白陽性率升高(P<0.05),Caspase-9陽性率降低(P<0.05)。5.相關(guān)性分析:5.1SOD、MDA與腎功能損害的相關(guān)性分析結(jié)果:SOD與血清Cr呈負相關(guān)(r=-0.916,P<0.01),MDA與血清Cr呈正相關(guān)(

11、r=0.807,P<0.05)。5.2SOD、MDA與凋亡的相關(guān)性分析:腎臟細胞凋亡率與SOD呈負相關(guān)(r=-0.827,P<0.01),與MDA呈正相關(guān)(r=0.607,P<0.05)。5.3SOD、MDA與凋亡相關(guān)蛋白Livin、Caspase-9的相關(guān)性分析:SOD與Caspase-9表達程度呈負相關(guān)(r=-0.382,P<0.05),MDA與Caspase-9表達程度呈正相關(guān)(r=0.356,P<0.05)；SOD與Livin表