基于miR-135a調控作用探討歸腎丸治療腎虛-薄型子宮內膜大鼠的機制研究.pdf

1、目的:
　　1.對目前成熟的兩個動物模型腎虛大鼠模型和薄型子宮內膜大鼠模型進行有機整合，建立腎虛-薄型子宮內膜大鼠模型，模擬臨床薄型子宮內膜患者證屬腎虛者，對建模的步驟、使用藥物及用藥時間加以明確，為研究薄型子宮內膜提供更符合臨床實際的病證結合模型，深入了解腎虛-薄型子宮內膜的病理特點，為探索有效的治療方法提供實驗基礎。
　　2.分析在歸腎丸影響下miR-135a對子宮內膜JAK2/STAT3信號通路及HOXA10基因的調控

2、作用，以期闡明歸腎丸治療薄型子宮內膜的靶點及藥效機制，從而豐富古方臨床適用范圍，也為中醫(yī)藥在輔助生殖技術中的應用提供科學依據。
　　方法:
　　1.通過SD大鼠官腔內注射95％乙醇和450mg/kg/天×8天羥基脲灌胃建立符合臨床病證實際的腎虛-薄型子宮內膜大鼠模型。HE染色檢測子宮內膜組織結構，測量子宮內膜厚度;免疫組化方法法檢測子宮內膜細胞標志蛋白角蛋白和波形蛋白的表達，以及檢測子宮內膜容受性標志蛋白VEGF蛋白的表達。

3、
　　2.建立腎虛-薄型子宮內膜大鼠模型后，采用歸腎丸灌胃液低、高劑量干預，雌激素作為陽性藥物對照組，兩個動情周期后，HE染色檢測子宮內膜組織結構，測量子宮內膜厚度;采用免疫組化法檢測大鼠子宮內膜上波形蛋白、角蛋白、VEGF蛋白、COX-2蛋白等表達;采用western-blot法檢測大鼠子宮內膜上JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3表達;采用qRT-PCR法檢測大鼠子宮內膜上miR-135a、HOXA10基因、IT

4、Gβ3基因、EMX2基因的表達變化。
　　結果:
　　1.腎虛-薄型子宮內膜建模成功，形態(tài)學上，對照組子宮內膜結構完整，造模組子宮內膜變薄，內膜欠連續(xù)，皺褶減少，部分腺上皮脫落，腺上皮及內膜上皮細胞呈低柱狀，甚至扁平狀;間質可見纖維組織增生，腺體稀疏，可見部分腺體腺上皮萎縮;造模組的平均內膜厚度(453.95±60.46um)較對照組內膜厚度(709.13±114.05um)?。≒＜0.01);造模組的脾臟、胸腺重量較對照組

5、減輕（P＜0.01)。
　　2.對照組的脾臟重量較其余各組均偏高（P＜0.05);歸腎丸低劑量組的脾臟重量較雌激素組、歸腎丸高劑量組的高（P＜0.05);對照組的胸腺重量較其余各組重，P值均＜0.05;歸腎丸低、高劑量組的胸腺重量比造模組、雌激素組的重（P＜0.05)。
　　3.造模組的子宮內膜厚度較其余各組均偏?。≒值均＜0.05）;對照組的子宮內膜厚度較其余各組均偏厚（P＜0.05);歸腎丸低、高劑量組與雌激素組比較無明

6、顯差異(P＞0.05)。
　　4.各組的VEGF蛋白表達均高于造模組，P＜0.05，差異具有統計學意義;與對照組比較，雌激素組、歸腎丸低、高劑量組的VEGF蛋白表達較高，P值均＜0.05，差異具有統計學意義;與雌激素組比較，歸腎丸低劑量組的VEGF表達較高，P值均＜0.05;對照組以及歸腎丸高劑量組的COX-2蛋白表達明顯高于其余各組（P值均＜0.05);雌激素組與歸腎丸低劑量組比較無差異(P＞0.05)，對照組與歸腎丸高劑量組比

7、較無差異(P＞0.05)
　　5.雌激素組、造模組相比較各組的ITGβ3蛋白表達均偏低，P值均＜0.05，差異具有統計學意義;歸腎丸低、高劑量組的的ITGβ3蛋白表達與對照組無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.造模組與對照組JAK2蛋白表達比較無統計學差異（P＞0.05）;歸腎丸各劑量組及雌激素組的JAK2蛋白表達均比造模組、對照組表達低（P值均＜0.05);歸腎丸高劑量組與雌激素組比較，歸腎丸高劑量組的JAK2蛋白表達高

8、，P＜0.05，差異具有統計學意義;造模組P-JAK2蛋白表達量較其余各組高（P＜0.05);對照組及雌激素組的STAT3蛋白表達較造模組，歸腎丸低、高劑量較造模組表達高（P值均＜0.05);對照組和雌激素組的蛋白表達較歸腎丸各劑量組高，（P值均＜0.05）;造模組的P-STAT3蛋白表達量與其余各組比較均偏高（P值均＜0.05）;歸腎丸低、高劑量組的P-STAT3蛋白表達量均較對照組和雌激素組的低，P值均＜0.05。
　　7.造

9、模組的ITGβ3基因的相對表達量較其余各組偏高（P值均＜0.05);雌激素組和歸腎丸高劑量組的ITGβ3基因的相對表達量較對照組高（P＜0.05）;對照組和歸腎丸低組之間比較無顯著性差異（P＞0.05）。
　　8.歸腎丸低劑量組的的HOXA10基因相對表達量較其余各組偏高（P值均＜0.05）;造模組的HOXA10基因相對表達量與其余各組比較均偏低（P值均＜0.05）。
　　9.與造模組比較，其余各組的miR-135a相對表達

10、量均較造模組高（P值均＜0.05）;歸腎丸高劑量組較對照組、歸腎丸低劑量組偏高（P值均＜0.05）。
　　10.miR-135a和JAK2蛋白表達高度負相關，r=-0.814，P＜0.01;miR-135a和P-JAK2低度負相關，r=-0.351，P＜0.01;miR-135a和P-STAT3蛋白表達中度負相關，r=-0.734，P＜0.01; miR-135a和STAT3蛋白表達不顯著相關。
　　11.JAK2和P-ST

11、AT3高度正相關，r=0.84，P＜0.01; P-JAK2蛋白與STAT3蛋白之間不相關。
　　12.JAK2和VEGF蛋白表達中度負相關，r=-0.75，P＜0.01; P-STAT3和VEGF蛋白表達中度負相關，r=-0.762，P＜0.01;P-STAT3和COX-2蛋白表達低度負相關，r=-0.478，P＜0.01;VEGF蛋白表達和COX-2蛋白表達低度相關，r=0.304，P＜0.05。
　　13.miR-13

12、5a和HOXA10基因表達不相關，r=0.273，P＞0.05;miR-135a和ITGβ3基因表達低度負相關，r=-0.307，P＜0.05; miR-135a和EMX2基因表達中度相關，r=-0.726.P＜0.01。
　　14.HOXM0基因和ITGβ3基因表達中度負相關，r=-0.565，P＜0.01;EMX2基因和ITGβ3基因表達低度正相關，r=0.389，P＜0.01。HOXA10基因和ITGβ3蛋白表達中度正相關，

13、r=0.772，P＜0.01
　　結論:
　　1.通過SD大鼠宮腔內注射95％乙醇和450mg/kg/天×8天羥基脲灌胃液灌胃可以建立符合臨床病證實際的腎虛-薄型子宮內膜大鼠模型，模型基本可以反映臨床薄型子宮內膜腎虛證的實際狀況。
　　2.歸腎丸能夠有效改善腎虛-薄型子宮內膜大鼠的腎虛相關癥狀，并且有效增加子宮內膜厚度，增強VEGF蛋白、COX-2蛋白以及ITGβ3蛋白在薄型子宮內膜的表達，有效促進子宮內膜的增生修復。

14、因此，可以在輔助生殖技術中對于薄型子宮內膜腎虛證患者加以歸腎丸作為輔助，以期提高患者妊娠成功率。
　　3.歸腎丸對JAK2、STAT3、P-JAK2以及P-STAT3蛋白的表達均具有抑制作用。歸腎丸低、高劑量組均對miR-135a的表達具有增強作用，其中以歸腎丸高劑量組尤其顯著;歸腎丸低、高劑量組均對EMX2基因的表達具有抑制作用，其中以歸腎丸高劑量組尤其顯著;歸腎丸對ITGβ3基因的表達具有抑制作用;歸腎丸作為一個多靶點的復方湯

15、劑，其復雜的藥效機制對多個基因及蛋白的表達均有影響，本研究為進一步的歸腎丸藥物研發(fā)提供了一定的理論基礎和科學依據。
　　4.基于miR-135a的調控作用，歸腎丸治療腎虛-薄型子宮內膜大鼠作用機制，通過上調miR-135a在子宮內膜的表達，對EMX2基因具有負性調節(jié)作用，從而達到改善子宮內膜容受性。miR-135a與HOXA10基因不相關，歸腎丸干預可以上調HOXA10基因的表達，增強子宮內膜的ITGβ3蛋白表達，從而達到改善子宮