基于miR-135a調(diào)控作用探討歸腎丸治療腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.對(duì)目前成熟的兩個(gè)動(dòng)物模型腎虛大鼠模型和薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型進(jìn)行有機(jī)整合，建立腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型，模擬臨床薄型子宮內(nèi)膜患者證屬腎虛者，對(duì)建模的步驟、使用藥物及用藥時(shí)間加以明確，為研究薄型子宮內(nèi)膜提供更符合臨床實(shí)際的病證結(jié)合模型，深入了解腎虛-薄型子宮內(nèi)膜的病理特點(diǎn)，為探索有效的治療方法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　2.分析在歸腎丸影響下miR-135a對(duì)子宮內(nèi)膜JAK2/STAT3信號(hào)通路及HOXA10基因的調(diào)控

2、作用，以期闡明歸腎丸治療薄型子宮內(nèi)膜的靶點(diǎn)及藥效機(jī)制，從而豐富古方臨床適用范圍，也為中醫(yī)藥在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1.通過(guò)SD大鼠官腔內(nèi)注射95％乙醇和450mg/kg/天×8天羥基脲灌胃建立符合臨床病證實(shí)際的腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型。HE染色檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)，測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度;免疫組化方法法檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞標(biāo)志蛋白角蛋白和波形蛋白的表達(dá)，以及檢測(cè)子宮內(nèi)膜容受性標(biāo)志蛋白VEGF蛋白的表達(dá)。

3、
　　2.建立腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型后，采用歸腎丸灌胃液低、高劑量干預(yù)，雌激素作為陽(yáng)性藥物對(duì)照組，兩個(gè)動(dòng)情周期后，HE染色檢測(cè)子宮內(nèi)膜組織結(jié)構(gòu)，測(cè)量子宮內(nèi)膜厚度;采用免疫組化法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜上波形蛋白、角蛋白、VEGF蛋白、COX-2蛋白等表達(dá);采用western-blot法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜上JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3表達(dá);采用qRT-PCR法檢測(cè)大鼠子宮內(nèi)膜上miR-135a、HOXA10基因、IT

4、Gβ3基因、EMX2基因的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.腎虛-薄型子宮內(nèi)膜建模成功，形態(tài)學(xué)上，對(duì)照組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，造模組子宮內(nèi)膜變薄，內(nèi)膜欠連續(xù)，皺褶減少，部分腺上皮脫落，腺上皮及內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈低柱狀，甚至扁平狀;間質(zhì)可見纖維組織增生，腺體稀疏，可見部分腺體腺上皮萎縮;造模組的平均內(nèi)膜厚度(453.95±60.46um)較對(duì)照組內(nèi)膜厚度(709.13±114.05um)?。≒＜0.01);造模組的脾臟、胸腺重量較對(duì)照組

5、減輕（P＜0.01)。
　　2.對(duì)照組的脾臟重量較其余各組均偏高（P＜0.05);歸腎丸低劑量組的脾臟重量較雌激素組、歸腎丸高劑量組的高（P＜0.05);對(duì)照組的胸腺重量較其余各組重，P值均＜0.05;歸腎丸低、高劑量組的胸腺重量比造模組、雌激素組的重（P＜0.05)。
　　3.造模組的子宮內(nèi)膜厚度較其余各組均偏薄（P值均＜0.05）;對(duì)照組的子宮內(nèi)膜厚度較其余各組均偏厚（P＜0.05);歸腎丸低、高劑量組與雌激素組比較無(wú)明

6、顯差異(P＞0.05)。
　　4.各組的VEGF蛋白表達(dá)均高于造模組，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與對(duì)照組比較，雌激素組、歸腎丸低、高劑量組的VEGF蛋白表達(dá)較高，P值均＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與雌激素組比較，歸腎丸低劑量組的VEGF表達(dá)較高，P值均＜0.05;對(duì)照組以及歸腎丸高劑量組的COX-2蛋白表達(dá)明顯高于其余各組（P值均＜0.05);雌激素組與歸腎丸低劑量組比較無(wú)差異(P＞0.05)，對(duì)照組與歸腎丸高劑量組比

7、較無(wú)差異(P＞0.05)
　　5.雌激素組、造模組相比較各組的ITGβ3蛋白表達(dá)均偏低，P值均＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;歸腎丸低、高劑量組的的ITGβ3蛋白表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　6.造模組與對(duì)照組JAK2蛋白表達(dá)比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）;歸腎丸各劑量組及雌激素組的JAK2蛋白表達(dá)均比造模組、對(duì)照組表達(dá)低（P值均＜0.05);歸腎丸高劑量組與雌激素組比較，歸腎丸高劑量組的JAK2蛋白表達(dá)高

8、，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;造模組P-JAK2蛋白表達(dá)量較其余各組高（P＜0.05);對(duì)照組及雌激素組的STAT3蛋白表達(dá)較造模組，歸腎丸低、高劑量較造模組表達(dá)高（P值均＜0.05);對(duì)照組和雌激素組的蛋白表達(dá)較歸腎丸各劑量組高，（P值均＜0.05）;造模組的P-STAT3蛋白表達(dá)量與其余各組比較均偏高（P值均＜0.05）;歸腎丸低、高劑量組的P-STAT3蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組和雌激素組的低，P值均＜0.05。
　　7.造

9、模組的ITGβ3基因的相對(duì)表達(dá)量較其余各組偏高（P值均＜0.05);雌激素組和歸腎丸高劑量組的ITGβ3基因的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組高（P＜0.05）;對(duì)照組和歸腎丸低組之間比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。
　　8.歸腎丸低劑量組的的HOXA10基因相對(duì)表達(dá)量較其余各組偏高（P值均＜0.05）;造模組的HOXA10基因相對(duì)表達(dá)量與其余各組比較均偏低（P值均＜0.05）。
　　9.與造模組比較，其余各組的miR-135a相對(duì)表達(dá)

10、量均較造模組高（P值均＜0.05）;歸腎丸高劑量組較對(duì)照組、歸腎丸低劑量組偏高（P值均＜0.05）。
　　10.miR-135a和JAK2蛋白表達(dá)高度負(fù)相關(guān)，r=-0.814，P＜0.01;miR-135a和P-JAK2低度負(fù)相關(guān)，r=-0.351，P＜0.01;miR-135a和P-STAT3蛋白表達(dá)中度負(fù)相關(guān)，r=-0.734，P＜0.01; miR-135a和STAT3蛋白表達(dá)不顯著相關(guān)。
　　11.JAK2和P-ST

11、AT3高度正相關(guān)，r=0.84，P＜0.01; P-JAK2蛋白與STAT3蛋白之間不相關(guān)。
　　12.JAK2和VEGF蛋白表達(dá)中度負(fù)相關(guān)，r=-0.75，P＜0.01; P-STAT3和VEGF蛋白表達(dá)中度負(fù)相關(guān)，r=-0.762，P＜0.01;P-STAT3和COX-2蛋白表達(dá)低度負(fù)相關(guān)，r=-0.478，P＜0.01;VEGF蛋白表達(dá)和COX-2蛋白表達(dá)低度相關(guān)，r=0.304，P＜0.05。
　　13.miR-13

12、5a和HOXA10基因表達(dá)不相關(guān)，r=0.273，P＞0.05;miR-135a和ITGβ3基因表達(dá)低度負(fù)相關(guān)，r=-0.307，P＜0.05; miR-135a和EMX2基因表達(dá)中度相關(guān)，r=-0.726.P＜0.01。
　　14.HOXM0基因和ITGβ3基因表達(dá)中度負(fù)相關(guān)，r=-0.565，P＜0.01;EMX2基因和ITGβ3基因表達(dá)低度正相關(guān)，r=0.389，P＜0.01。HOXA10基因和ITGβ3蛋白表達(dá)中度正相關(guān)，

13、r=0.772，P＜0.01
　　結(jié)論:
　　1.通過(guò)SD大鼠宮腔內(nèi)注射95％乙醇和450mg/kg/天×8天羥基脲灌胃液灌胃可以建立符合臨床病證實(shí)際的腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠模型，模型基本可以反映臨床薄型子宮內(nèi)膜腎虛證的實(shí)際狀況。
　　2.歸腎丸能夠有效改善腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠的腎虛相關(guān)癥狀，并且有效增加子宮內(nèi)膜厚度，增強(qiáng)VEGF蛋白、COX-2蛋白以及ITGβ3蛋白在薄型子宮內(nèi)膜的表達(dá)，有效促進(jìn)子宮內(nèi)膜的增生修復(fù)。

14、因此，可以在輔助生殖技術(shù)中對(duì)于薄型子宮內(nèi)膜腎虛證患者加以歸腎丸作為輔助，以期提高患者妊娠成功率。
　　3.歸腎丸對(duì)JAK2、STAT3、P-JAK2以及P-STAT3蛋白的表達(dá)均具有抑制作用。歸腎丸低、高劑量組均對(duì)miR-135a的表達(dá)具有增強(qiáng)作用，其中以歸腎丸高劑量組尤其顯著;歸腎丸低、高劑量組均對(duì)EMX2基因的表達(dá)具有抑制作用，其中以歸腎丸高劑量組尤其顯著;歸腎丸對(duì)ITGβ3基因的表達(dá)具有抑制作用;歸腎丸作為一個(gè)多靶點(diǎn)的復(fù)方湯

15、劑，其復(fù)雜的藥效機(jī)制對(duì)多個(gè)基因及蛋白的表達(dá)均有影響，本研究為進(jìn)一步的歸腎丸藥物研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。
　　4.基于miR-135a的調(diào)控作用，歸腎丸治療腎虛-薄型子宮內(nèi)膜大鼠作用機(jī)制，通過(guò)上調(diào)miR-135a在子宮內(nèi)膜的表達(dá)，對(duì)EMX2基因具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，從而達(dá)到改善子宮內(nèi)膜容受性。miR-135a與HOXA10基因不相關(guān)，歸腎丸干預(yù)可以上調(diào)HOXA10基因的表達(dá)，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜的ITGβ3蛋白表達(dá)，從而達(dá)到改善子宮