基于DIP病毒的腫瘤相關(guān)γ皰疹病毒-宿主拮抗機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　人類(lèi)γ皰疹病毒與一些惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如EBV與Burkitt's淋巴瘤、霍奇金病、鼻咽癌(NPC)等相關(guān)，HHV-8/KSHV與卡波西肉瘤(KS)（AIDS病人中最常見(jiàn)的腫瘤）、原發(fā)性滲出性淋巴瘤(PEL)和多灶性卡斯特萊曼病(MCD)等相關(guān)。γ皰疹病毒感染宿主后，經(jīng)過(guò)急性裂解復(fù)制階段，可以快速被宿主清除但能通過(guò)多種免疫逃逸策略在宿主中建立潛伏感染，并終身存在宿主體內(nèi)。潛伏感染及免疫逃逸的存在使得被感染細(xì)胞容易

2、轉(zhuǎn)化，與惡性腫瘤形成密切相關(guān)。
　　EBV和KSHV為種屬特異性病毒，僅能感染人類(lèi)和一些靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，且無(wú)法建立有效的細(xì)胞感染模型。鼠皰疹病毒68(murine herpesvirus68，MHV-68)是從野生倉(cāng)鼠中分離得到的一種γ皰疹病毒，與人類(lèi)γ皰疹病毒高度同源，并可感染小鼠等模式動(dòng)物。因此，成為人類(lèi)研究γ皰疹病毒與其宿主相互作用及探究各種γ皰疹病毒疫苗有效性的很有價(jià)值的模型。
　　RTA（replication and

3、 transcription activator，復(fù)制和轉(zhuǎn)錄活化位點(diǎn)）是調(diào)節(jié)皰疹病毒從潛伏期進(jìn)入裂解復(fù)制的一個(gè)關(guān)鍵即刻早期基因產(chǎn)物。RTA在γ皰疹病毒中是保守的。RTA的表達(dá)可活化裂解復(fù)制相關(guān)基因，打破病毒潛伏狀態(tài)，促使病毒進(jìn)入裂解復(fù)制。RTA的持續(xù)表達(dá)則可抑制病毒建立潛伏感染。已知，在MHV-68基因組中，ORF73的產(chǎn)物可抑制RTA的表達(dá)和功能，敲除ORF73的病毒其潛伏感染能力下降。ORF72、M11和ORF74位于ORF73附近

4、，這些基因在病毒的潛伏期進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，與病毒的潛伏感染及致瘤性密切相關(guān)。
　　與其他腫瘤相關(guān)皰疹病毒一樣，MHV-68存在多種免疫逃逸機(jī)制來(lái)抑制宿主的天然免疫和適應(yīng)性免疫。其ORF10、11、36、54可以抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生或者發(fā)揮作用，其M3基因具有泛素連接酶功能，能降低MHCⅠ類(lèi)分子在感染細(xì)胞表面的表達(dá)，去除這些基因可提高宿主對(duì)病毒的識(shí)別及殺傷。
　　基于以上認(rèn)識(shí)，我們?cè)贛HV-68背景基礎(chǔ)上構(gòu)建了DIP(deficient

5、 in immuneevasion and persistence)重組病毒，該病毒去除了ORF10、11、36、54、 M3等抑制宿主免疫反應(yīng)的基因以及ORF72、73、74、M11等潛伏期相關(guān)基因并持續(xù)活化復(fù)制和轉(zhuǎn)錄激活蛋白(RTA)。小鼠接種試驗(yàn)表明DIP不會(huì)建立潛伏感染、并提供免疫保護(hù)作用。因此，將DIP作為一個(gè)“工具病毒”，研究該病毒的生物學(xué)特征及其刺激宿主所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，將有組于我們理解機(jī)體抗病毒免疫調(diào)控機(jī)制，并加深我們對(duì)

6、γ皰疹病毒潛伏感染和免疫逃逸的認(rèn)識(shí)。
　　本文的研究目的是通過(guò)對(duì)DIP病毒體內(nèi)復(fù)制特性和誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)的研究，尋找宿主調(diào)控病毒潛伏感染和免疫逃逸的可能機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)DIP MHV-68感染可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的IFN-γ。因此我們進(jìn)一步明確了IFN-γ對(duì)MHV-68裂解復(fù)制的作用和MHV-68抗IFN-γ的效應(yīng)及Ⅰ型干擾素在IFN-γ抗MHV-68感染過(guò)程中所起的作用。
　　方法和結(jié)果：
　　本文的第一部分我們對(duì)構(gòu)建的

7、DIP MHV-68在體內(nèi)的復(fù)制特性及宿主的免疫應(yīng)答進(jìn)行了研究。通過(guò)建立體內(nèi)感染模型:BALB/c小鼠經(jīng)鼻感染DIP MHV-68或者野生病毒，分別于感染后3天、6天和14天，收集肺組織或脾組織，通過(guò)plaque assay或者infectious center assay檢測(cè)病毒的裂解復(fù)制和潛伏感染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DIP無(wú)法在體內(nèi)建立裂解復(fù)制和潛伏感染。RT-qPCR動(dòng)態(tài)的檢測(cè)病毒基因和細(xì)胞炎癥因子、干擾素相關(guān)因子和一些細(xì)胞因子的表達(dá)，

8、發(fā)現(xiàn)DIP病毒感染后，病毒基因轉(zhuǎn)錄水平迅速升高，感染后第3天達(dá)到高峰，而后開(kāi)始下降，于第6天降至較低的水平。而IFN-γ的表達(dá)量在第6天明顯高于野生病毒，炎癥因子IL-1β和TNF-α感染后第1天即達(dá)高峰，而后逐漸下降，至第6天與野生病毒相似。ELISA結(jié)果顯示DIP感染后第6天小鼠血清和肺泡灌洗液中IFN-γ分泌量明顯增高。以上研究結(jié)果提示我們，IFN-γ在MHV-68感染免疫中發(fā)揮了重要的作用，后面的研究?jī)?nèi)容集中于IFN-γ與MHV

9、-68的相互作用展開(kāi)。
　　本文的第二部分我們對(duì)IFN-γ在MHV-68裂解復(fù)制中的效應(yīng)進(jìn)行了研究。首先我們將野生MHV-68經(jīng)鼻感染W(wǎng)T和IFN-γR-/-小鼠，plaque assay和DNAPCR分別檢測(cè)病毒滴度和DNA拷貝數(shù)，結(jié)果顯示W(wǎng)T和IFN-γ R-/-小鼠之間沒(méi)有明顯的差別，病毒腹腔感染小鼠也出現(xiàn)同樣的結(jié)果。通過(guò)RT-qPCR和ELISA檢測(cè)野生病毒感染C57BL/6和BALB/c小鼠后IFN-γ的表達(dá)和分泌情況，

10、發(fā)現(xiàn)均產(chǎn)生極低的IFN-γ。而腹腔注射IFN-γ可以抑制腹腔感染病毒的復(fù)制。IFN-γ預(yù)處理BMM、RAW264.7、MEF、NIH3T3和MLE-12細(xì)胞可顯著抑制MHV-68在這些細(xì)胞的復(fù)制，表現(xiàn)為病毒滴度下降、DNA拷貝數(shù)下降、ORF50表達(dá)下降。提取IFN-γ R-/-小鼠的BMM細(xì)胞和PM細(xì)胞檢測(cè)IFN-γ的抗病毒作用，發(fā)現(xiàn)IFN-γ抑制MHV-68的復(fù)制作用依賴IFN-γ受體的完整性。
　　本文的第三部分對(duì)Ⅰ型干擾素與

11、Ⅱ干擾素交互作用對(duì)IFN-γ抗病毒作用的影響及其機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)RT-qPCR和ELISA，我們發(fā)現(xiàn)IFN-γ預(yù)處理的BMM細(xì)胞感染MHV-68后可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的表達(dá)和分泌。通過(guò)中和抗體抑制IFN-α明確分泌的IFN-α具有抑制MHV-68復(fù)制的活性。RT-qPCR結(jié)果顯示IFN-γ可以誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素下游ISGs的表達(dá)，包括MX1和IRF7。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)IFN-γ對(duì)Toll樣受體的調(diào)節(jié)作用顯示IFN-γ可以上調(diào)BMM細(xì)

12、胞上TLR9的表達(dá)，且上調(diào)作用依賴于IFN-γ受體和STAT1。Western blotting發(fā)現(xiàn)BMM細(xì)胞感染MHV-68后，IFN-γ上調(diào)TLR9可使IRF7磷酸化增強(qiáng)。抑制劑或者小干擾RNA抑制TLR9后，Ⅰ型干擾素產(chǎn)生明顯下降，伴隨著IFN-γ的抗病毒作用減弱。通過(guò)ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)p-STAT1不能與TLR9的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。
　　本文的第四部分，我們研究了病毒拮抗IFN-γ的作用及相關(guān)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)MHV-

13、68感染BMM細(xì)胞可以誘導(dǎo)SOCS1產(chǎn)生，抑制STAT1的磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒作用。通過(guò)檢測(cè)病毒的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)IFN-γ誘導(dǎo)的抗病毒作用在MHV-68感染的BMM細(xì)胞逐漸減弱，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著感染時(shí)間延長(zhǎng)，STAT1磷酸化水平被抑制。通過(guò)篩選JAK-STAT1負(fù)向調(diào)控因子發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細(xì)胞可以上調(diào)SOCS1的表達(dá)，且UV滅活的MHV-68無(wú)法誘導(dǎo)SOCS1產(chǎn)生。BMM細(xì)胞轉(zhuǎn)染SOCS

14、1特異性的siRNA可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象，表現(xiàn)為IFN-γ的抗病毒作用增強(qiáng)且誘導(dǎo)的STAT1磷酸化持續(xù)活化。通過(guò)轉(zhuǎn)染TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR9特異性的siRNA檢測(cè)SOCS1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)TLR3的表達(dá)，SOCS1產(chǎn)生明顯下降;且TLR3信號(hào)通路激動(dòng)劑poly(I∶C)可以誘導(dǎo)SOCS1的表達(dá);BMM細(xì)胞干擾或者敲除MyD88對(duì)SOCS1產(chǎn)生沒(méi)有影響。Western blotting檢測(cè)MHV-68感染后TLR3下游

15、信號(hào)通路活化情況，發(fā)現(xiàn)MHV-68感染BMM細(xì)胞可以活化NF-κB、p38、ERK、JNK信號(hào)通路。用這些信號(hào)通路的特異性抑制劑處理細(xì)胞后顯示只有抑制NF-κ B后，SOCS1產(chǎn)生下降。最后，我們?nèi)〔槐磉_(dá)TLR3的NIH3T3細(xì)胞，IFN-γ處理可以持續(xù)抑制MHV-68的復(fù)制，表現(xiàn)為病毒滴度持續(xù)下降，并且STAT1磷酸化水平保持穩(wěn)定。過(guò)表達(dá)SOCS1可使IFN-γ的抗病毒作用減弱，伴隨著STAT1磷酸化水平的下降。
　　結(jié)論：

16、r>　　1.DIP MHV-68病毒無(wú)法在BALB/c小鼠體內(nèi)建立裂解復(fù)制和潛伏感染并可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的IFN-γ，說(shuō)明IFN-γ可能在此過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用且野生病毒存在抑制IFN-γ產(chǎn)生的機(jī)制。
　　2.IFN-γ可直接抑制MHV-68的復(fù)制且抑制效應(yīng)具有廣泛性:IFN-γ經(jīng)與IFN-γ受體結(jié)合，抑制MHV-68在巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞的復(fù)制。
　　3.在BMM細(xì)胞，IFN-γ抑制MHV-68存在新的機(jī)制:I

17、FN-γ通過(guò)上調(diào)Toll樣受體9的表達(dá)，誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素產(chǎn)生，Ⅰ型干擾素與Ⅱ型干擾素協(xié)同發(fā)揮抗病毒的作用。
　　4.MHV-68利用宿主因素作為病毒拮抗IFN-γ的機(jī)制以利于病毒的存活:在BMM細(xì)胞，MHV-68感染活化TLR3-TRAF-NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生宿主性細(xì)胞因子SOCS1抑制STAT1磷酸化從而抑制IFN-γ的抗病毒效應(yīng)。
　　創(chuàng)新性：
　　1.以鼠γ皰疹病毒MHV-68為研究模型，率先構(gòu)建了一個(gè)裂解復(fù)制、

18、潛伏感染、免疫逃逸缺陷的重組病毒DIP。通過(guò)對(duì)該病毒的研究，有助于我們了解病毒潛伏感染、免疫逃逸機(jī)制及γ皰疹病毒如EBV、KSHV的致瘤機(jī)制。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)IFN-γ通過(guò)上調(diào)TLR9的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。我們的研究除了闡明IFN-γ抑制MHV-68裂解復(fù)制的機(jī)理外，還有助于了解Ⅰ型干擾素和Ⅱ型干擾素在腫瘤相關(guān)病毒感染過(guò)程中的相互關(guān)系。
　　3.闡明MHV-68感染BMM細(xì)胞可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生SOCS1來(lái)抑制IF