無機砷對大鼠HSC纖維化改變及DNMTs表達的實驗觀察.pdf

1、目的：研究不同劑量無機砷刺激大鼠肝星狀細胞(HSC)后其纖維化情況，觀察在此過程中DNMTs的變化，為進一步闡述無機砷致肝損傷的作用機制提供依據(jù)。
　　方法：1.采用MTT還原法檢測細胞生長情況和細胞活力；確定LC50和染毒濃度即亞砷酸鈉(As3+)低、中、高劑量組和砷酸鈉(As5+)低、中、高劑量組。2.流式細胞儀(FCM)檢測不同劑量和時間點的大鼠HSC-T6的凋亡情況。3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Imm

2、unosorbentAssays,ELISA)檢測無機砷干預大鼠HSC-T6后的Ⅰ型膠原(COL-1)、Ⅲ型膠原(COL-3)和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的含量。4.通過實時熒光定量(Real-Time Quantitative PCR)檢測無機砷干預大鼠HSC-T6后TGF-β1、DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3l的mRNA的表達水平。5.蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗)即Western Blot檢測無機

3、砷干預大鼠HSC-T6后TGF-β1和DNMT3a在細胞內(nèi)的蛋白表達。
　　結果：1.無機砷染毒 HSC-T6細胞48h時，測得 As3+的LC50為60.00μmol/L，As5+的LC50為93.00μmol/L，即亞砷酸鈉組的低、中、高劑量依次是5μmol/L、15μmol/L、25μmol/L。砷酸鈉組的低、中、高劑量依次是20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L。對照組為0μmol/L。細胞的增殖活力隨劑量時

4、間升高而降低。2.在24h時，除五價砷低劑量組外其它染毒組的凋亡率都高于對照組(P﹤0.05)；48h和72h時隨著染砷濃度的增加，凋亡率逐漸升高(P﹤0.05)。濃度一定時，所有染砷組隨著染砷時間的增加凋亡率升高(P﹤0.05)。3.各染砷組的COL-1、COL-3、α-SMA的含量隨染砷時間和染砷劑量的增加而升高(P﹤0.05)。4.與對照組相比TGF-β1的mRNA表達水平隨染砷劑量的增加而上調(diào)(P﹤0.05)；相同濃度隨著染砷時

5、間的延長，TGF-β1的mRNA表達水平也在不斷的增加(P﹤0.05)。5.在同一時間下，DNMT1的mRNA表達量隨染砷濃度的升高而上調(diào)(P﹤0.05)；同一濃度下，DNMT1mRNA的表達量隨染砷時間遞增而下調(diào)(P﹤0.05)。6.同一時間下，隨三價砷染毒劑量的升高DNMT2mRNA的表達水平呈現(xiàn)為上調(diào)(P﹤0.05)，而五價砷染毒劑量的升高DNMT2mRNA的表達水平呈現(xiàn)為下調(diào)(P﹤0.05)。同一濃度下，在48h時三價中、高劑量

6、組與五價低、高劑量組DNMT2mRNA的表達水平為上調(diào)(P﹤0.05)。7.DNMT3a的mRNA的表達量隨染砷劑量的升高在降低(P﹤0.05)，但仍是上調(diào)；同一劑量組下，隨染毒時間的延長DNMT3a的mRNA表達水平為上調(diào)(P﹤0.05)。8.同一時間下，24h時三價砷低劑量組DNMT3b的mRNA是表達上調(diào)(P﹤0.05)，其它組都是表達下調(diào)(P﹤0.05)；48h時DNMT3b的mRNA在三價砷中劑量組表達下調(diào)，但在三價砷高劑量組

7、及五價砷低、高劑量組表達上調(diào)(P﹤0.05)。濃度一定的情況下，48h、72h時DNMT3b的mRNA的表達在三價砷中劑量與五價砷中劑量為下調(diào)(P﹤0.05)，其余為上調(diào)(P﹤0.05)。9.24h時三價砷高劑量組，五價砷中、高劑量組DNMT3l的mRNA表達為上調(diào)(P﹤0.05)，48h時三價砷中、高劑量組DNMT3l的mRNA表達為上調(diào)(P﹤0.05)。72h時三價砷中劑量組顯示為上調(diào)(P﹤0.05)。同一濃度下，在48h、72h時

8、的所有染砷組的DNMT3l的mRNA的表達水平除三價中劑量是上調(diào)，其它組是下調(diào)(P﹤0.05)。10.對無機砷誘導 HSC-T6細胞72h時的各基因做相關分析，TGF-β1mRNA的表達與DNMT2mRNA的表達和DNMT3amRNA的表達呈高度正相關(P﹤0.01)。11.Western Blot檢測顯示TGF-β1和DNMT3a在細胞內(nèi)的蛋白表達隨時間和濃度的增加而上升。且不同組間和不同時間差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。