尖塘鱧屬魚類分子系統(tǒng)學(xué)及云斑尖塘鱧AFLP分子標(biāo)記技術(shù)體系的建立.pdf

1、本文選擇2種尖塘鱧(云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧)及塘鱧屬中的尖頭塘鱧，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已提交序列，運(yùn)用線粒體(mtDNA)部分基因序列分析技術(shù)構(gòu)建尖塘鱧屬的分子系統(tǒng)樹；同時(shí)分別以云斑尖塘鱧和線紋尖塘鱧為對(duì)象，運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)從分子水平探討它們的遺傳多樣性和親緣關(guān)系；并通過(guò)云斑尖塘鱧AFLP分析體系的建立，為今后進(jìn)一步研究云斑尖塘鱧的群體遺傳多樣性和遺傳圖譜的構(gòu)建等積累基礎(chǔ)資料。本研究主要結(jié)果如下：
　　 1.通過(guò)

2、PCR法得到云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧和尖頭塘鱧的線粒體16S rRNA基因部分序列(569bp)及CO II基因全序列(691bp)，并結(jié)合從GenBank中下載的平頭沙塘鱧、溪鱧及刺蓋塘鱧的16S rRNA基因部分同源序列及CO II基因全序列，分析了6種塘鱧科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
　　 (1)通過(guò)對(duì)16S rRNA基因部分同源序列的比對(duì)分析，運(yùn)用MAGA 4.0軟件分析，塘鱧魚類6個(gè)種之間存在142個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)

3、57個(gè)，轉(zhuǎn)換/顛換之比為1.6，表明塘鱧科魚類16S rRNA基因序列轉(zhuǎn)換/顛換未達(dá)飽和；6種塘鱧科魚類之間的序列差異在0.054-0.147之間，其中平頭沙塘鱧和刺蓋塘鱧的序列差異最大(0.147)，線紋尖塘鱧與云斑尖塘鱧的序列差異最小(0.054)，且種間序列差異不大。通過(guò)NJ、ME、MP系統(tǒng)樹的建立，表明線紋尖塘鱧與云斑尖塘鱧的親緣關(guān)系最近，且尖塘鱧屬與塘鱧屬魚類的同源性不高，驗(yàn)證了傳統(tǒng)分類學(xué)把尖塘鱧獨(dú)立成屬的科學(xué)性。
　　

4、 (2)通過(guò)對(duì)CO II基因全序列的對(duì)比分析，云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧及尖頭塘鱧的CO II基因序列相似度100％，它們與刺蓋塘鱧及平頭沙塘鱧的堿基同源性相對(duì)較高(84％)，而與溪鱧的堿基同源性較低(80％)。用MEGA 4.0軟件分析CO II基因，通過(guò)NJ及ME系統(tǒng)樹的建立，表明云斑尖塘鱧、線紋尖塘鱧及尖頭塘鱧的親緣關(guān)系最近，且尖塘鱧屬與塘鱧屬的親緣關(guān)系較近。CO II基因被認(rèn)為是進(jìn)化速率較高且含有較多進(jìn)化信息位點(diǎn)的線粒體基因，適用

5、于較低分類單元的研究，而在本文所研究的3個(gè)物種中，CO II基因呈現(xiàn)出非常低的進(jìn)化速率。
　　 2.應(yīng)用RAPD技術(shù)對(duì)云斑尖塘鱧及線紋尖塘鱧2個(gè)種的養(yǎng)殖群體進(jìn)行研究，從100個(gè)隨機(jī)引物中篩選出20個(gè)擴(kuò)增帶豐富的引物進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出170個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為116個(gè)(68.24％)。實(shí)驗(yàn)所用引物均能擴(kuò)增出種特異性RAPD條帶，這些特異條帶可以作為2種尖塘鱧的分子鑒定標(biāo)記。運(yùn)用Popgene 1.32軟件進(jìn)行擴(kuò)增帶譜統(tǒng)計(jì)分析，云斑

6、尖塘鱧與線紋尖塘鱧兩個(gè)種的平均Shannon多樣性指數(shù)為0.4683，遺傳相似率為0.3176，遺傳距離為1.1468。結(jié)果表明，云斑尖塘鱧及線紋尖塘鱧群體內(nèi)差異較小，兩個(gè)種種間差異較大。
　　 3.構(gòu)建了云斑尖塘鱧擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)分析體系，對(duì)連接反應(yīng)、預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)、選擇性擴(kuò)增反應(yīng)等步驟進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，采用磷酸化接頭、預(yù)擴(kuò)增PCR預(yù)變性前加72℃ 5min的延伸和稀釋20倍預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為選擇性擴(kuò)增模板，可得到十分