Mnk2作為非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后因子及其分子基礎(chǔ).pdf

1、目的：
　　由于Mnk2(主要是Mnk2A)較Mnk1有更高的生物活性[15]，且在我們前期的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在腫瘤標(biāo)本及肺癌細(xì)胞株中Mnk2有更高的表達(dá)水平，所以是近年來的研究熱點(diǎn)也是我們的研究重點(diǎn)。我們擬通過對(duì)石蠟切片，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株以及移植瘤動(dòng)物模型三個(gè)方面對(duì)Mnk2進(jìn)行檢測，了解Mnk2在非小細(xì)胞肺癌中對(duì)預(yù)后的提示意義及其分子基礎(chǔ)。
　　第一章 Mnk2蛋白表達(dá)水平與患者術(shù)后生存率及臨床病理特征的關(guān)系
　　方法

2、:
　　收集2006年10月至2009年6月經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷的367例非小細(xì)胞肺癌病例的組織標(biāo)本及其中117例癌旁正常肺組織。所有標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE染色，選取合適區(qū)域制作組織芯片蠟塊，經(jīng)免疫組化二步法檢測MNK2蛋白的表達(dá)水平，按細(xì)胞著色范圍及強(qiáng)度，根據(jù)中位數(shù)將MNK2表達(dá)水平分為低表達(dá)組及高表達(dá)組。
　　結(jié)果:
　　1.Mnk2蛋白表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞的胞漿，相對(duì)于癌旁組織，肺癌組織中Mnk2

3、的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(log-ranktest,t=-11.397, P＜0.001)。
　　2.在367例非小細(xì)胞肺癌組織中，Mnk2蛋白高表達(dá)的有220例，高表達(dá)率為59.5％(220/367)?；颊叩?年總生存(OS)比率為45.74％，5年無病生存率(DFS)為43.83％。
　　3.Mnk2低表達(dá)組(n=147)和高表達(dá)組(n=220)的OS比率分別為60.39％和36.01％，兩組有顯著性差

4、異(log-rank test，X2=16.382，P＜0.001);DFS比率分別為57.26％和35.04％，兩組有顯著性差異(log-rank test，X2=16.982，P＜0.001)。
　　4.在早中期病例中（Ⅰ+Ⅱ期），Mnk2表達(dá)水平與病人預(yù)后有顯著相關(guān)性，Mnk2低表達(dá)組(n=102)和高表達(dá)組(n=131)的5年生存率分別為67.43％和51.54％，兩組有顯著性差異（log-rank test，X2=5.1

5、23，P=0.024）;5年無病生存率分別為66.30％和50.42％，兩組有顯著性差異（log-rank test，X2=5.058，P=0.025，P=0.025）。
　　結(jié)論:
　　1.Mnk2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞組織中高表達(dá)，Mnk2蛋白定位于腫瘤細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞的胞漿。
　　2.367例非小細(xì)胞肺癌患者M(jìn)nk2高表達(dá)組的生存率明顯低于低表達(dá)組;
　　3.臨床分期Ⅰ-Ⅱ期（早，中期）及Ⅲ-Ⅳ期（中，晚期

6、）非小細(xì)胞肺癌中Mnk2的表達(dá)水平與患者預(yù)后顯著相關(guān);
　　4.肺腺癌中Mnk2的表達(dá)水平與患者預(yù)后顯著相關(guān);
　　5.Mnk2高表達(dá)和N分期分別是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的獨(dú)立指標(biāo)之一;
　　6.Mnk2的表達(dá)水平與N分期有顯著相關(guān)性，而與年齡、性別、臨床分期、組織類型、吸煙及T分期沒有相關(guān)性。
　　7.MNK2與eIF4E、P-eIF4E的蛋白表達(dá)具有正性相關(guān)。提示MNK2在MAPK通路中可能通過eIF4E及磷酸

7、化eIF4E起作用。
　　第二章 MNK2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及沉默后體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)
　　方法:
　　1.選擇對(duì)數(shù)生長期的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、NCI-H1650、SPC-A-1)以及正常支氣管上皮細(xì)胞株16HBE，采用熒光定量PCR方法檢測各細(xì)胞株中Mnk2的表達(dá)水平;
　　2.Mnk2基因沉默采用化學(xué)合成的siRNA序列，序列為:se

8、nse5'UCGUCAAGAUCAUUGAGAATT--3'及anti-sense5'-UUCUCAAUGAUCUUGACGGTT-3'，轉(zhuǎn)染A549,NCI-H460及NCI-H1975細(xì)胞株;
　　3.使用Mnk2-siRNA和Negative control進(jìn)行細(xì)胞體外功能實(shí)驗(yàn)，包括:CCK細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Transwell小室體外遷移實(shí)驗(yàn);
　　結(jié)果:
　　1.在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、

9、NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、SPC-A-1、NCI-H1650)及正常支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)中，NCI-H1975的Mnk2表達(dá)水平最高。應(yīng)用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)表明與16HBE相比，Mnk2-mRNA在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H520、A549及SPC-A-1中高表達(dá)(P＜0.05，Independent-Samples t test)。單因素方差分析方差齊性檢(

10、LSD)顯示MNK2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株及正常支氣管上皮細(xì)胞株中的表達(dá)有顯著差異(P*＜0.001，F(xiàn)*值=43.494，)。
　　2.免疫熒光檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1650)及正常支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示Mnk2在H1975、H460、A549三個(gè)細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。而相對(duì)于16HBE，在SPC-A-1、H1650細(xì)胞中的表達(dá)降低。

11、　　3.免疫印跡檢測非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(A549、H1975、H460、SPC-A-1、H1299、H1650)及正常支氣管上皮細(xì)胞株(16HBE)中Mnk2的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示Mnk2在H1975、H460、A549、H1299四個(gè)細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)。而相對(duì)于16HBE，在SPC-A-1、H1650細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)。
　　4.采用熒光定量RT-PCR檢測A549細(xì)胞中Mnk2-siRNA組及Negative control組中

12、Mnk2的表達(dá)水平顯示:Mnk2在Mnk2-siRNA組中的表達(dá)水平明顯低于Negative control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-13.742，P＜0.001，Independent-Samples t test);
　　結(jié)論:
　　1.在肺癌細(xì)胞株中，Mnk2的表達(dá)水平明顯高于正常支氣管上皮細(xì)胞，提示 Mnk2是肺癌信號(hào)通路中被激活的一類蛋白;
　　2.在轉(zhuǎn)染了Mnk2-siRNA的肺癌細(xì)胞株中，細(xì)胞增殖，細(xì)

13、胞克隆能力及體外遷移能力受到抑制，提示Mnk2是惡性腫瘤發(fā)生，發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素之一。
　　第三章 Mnk2沉默后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　方法:
　　1.通過慢病毒轉(zhuǎn)染A549及NCI-H460細(xì)胞的方法構(gòu)建Mnk2-shRNA-A549及Mnk2-shRNA-H460;
　　2.選用處于對(duì)數(shù)生長期的A549和NCI-H460細(xì)胞，轉(zhuǎn)染慢病毒Mnk2-shRNA或negative control后使用DMEM培養(yǎng)

14、基稀釋到濃度為2×106/ml及3×106/ml;
　　3.將細(xì)胞分別注射于裸鼠脅腹側(cè)，4天后開始觀察腫瘤大小，每3天記錄一次，在適當(dāng)時(shí)候處死裸鼠，剔出瘤體并稱重，行石蠟包埋切片并行HE染色，顯微鏡下觀察。
　　4.將細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注入裸鼠體內(nèi)，接種3天后觀察裸鼠狀態(tài)，30天時(shí)處死裸鼠，取肝臟組織觀察其表面成瘤數(shù)目。
　　結(jié)果:
　　1.在注射的A549細(xì)胞株的各7只裸鼠中， NC組的所有裸鼠均成瘤，Mnk2-sh

15、RNA組只有6只(85.7％)裸鼠成瘤，成瘤時(shí)間在第10天后。兩組成瘤速度統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異P＜0.05，Independent-Samples t test)。處死裸鼠后，A549細(xì)胞株Mnk2-shRNA組瘤重0.05±0.049g，小于NC組瘤重(0.149±0.722g)(t=-2.976,P=0.012,two-independent t test);
　　2.在注射的NCI-H460細(xì)胞株的各7只裸鼠中，NC組的所有裸鼠

16、均成瘤，Mnk2-shRNA組只有6只(85.7％)裸鼠成瘤，成瘤時(shí)間在第7天后。Mnk2-shRNA組的成瘤速度比NC組成瘤速度慢，但兩組的成瘤速度之間除了第7天統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(P=0.031，Independent-Samples t test)之外，之后的腫瘤體積無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，Independent-Samples t test)。處死裸鼠后，NCI-H460細(xì)胞株Mnk2-shRNA組瘤重0.217±0.152g

17、，小于NC組瘤重(0.343±0.078g)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒意義(t=-1.947，P=0.075，Independent-Samples ttest);
　　3.在注射A549細(xì)胞株的各5只裸鼠中，Mnk2-shRNA組的所有裸鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)（3±1個(gè)）比NC組的肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)（10±3個(gè)）明顯減少，兩組成瘤速度統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異(t=-5.259，P=0.001，Independent-Samples t test);
　　結(jié)論