智能納米微載體負載血小板衍生生長因子C防治靜脈血栓形成的初步研究.pdf

1、目的:(1)觀察血小板衍生生長因子C(platelet-derived growth factor-C，PDGF-C)對血管內(nèi)皮細胞及間充質(zhì)干細胞的影響;(2)制備具有靶向抗凝負載PDGF-C的納米微載體;(3)驗證靶向抗凝納米微載體負載PDGF-C對血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的治療作用。
　　方法:(1)體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞并進行鑒定，不同濃度梯度的PDGF-C干預(yù)，觀察對兩種細胞增殖能力及遷移能力的影響。MTT法繪制生

2、長曲線，比較細胞增殖能力;流式檢測細胞周期;細胞劃痕實驗及transwell細胞遷移實驗比較對細胞遷移能力影響。(2)雙乳相法合成納米殼聚糖微載體，磺化反應(yīng)合成磺酸化殼聚糖微載體，利用微載體吸附PDGF-C及肌球蛋白4抗體。通過透射電鏡描述其形態(tài)特征，紅外光譜及體外抗凝試驗對其理化特征進行描述，采用溶血實驗、細胞毒性實驗評價其生物安全性。(3)機械夾閉小鼠腎靜脈下段下腔靜脈建立內(nèi)皮損傷模型，動物實驗分三組，均在1、2、3天給藥并給予肝素

3、抗凝治療防止血栓形成，給藥后第1、3、7天取出損傷段下腔靜脈，HE染色及vWF免疫熒光染色觀察血管損傷及修復(fù)情況;活體伊文氏藍染料(Evans blue)染色損傷的下腔靜脈，采用Lucia軟件計算染色血管和總血管面積，計算再內(nèi)皮化程度。
　　結(jié)果:(1)PDGF-C能明顯刺激血管內(nèi)皮細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖，增加兩種細胞S期細胞的比例，對內(nèi)皮細胞增殖成劑量依賴關(guān)系，對間充質(zhì)干細胞的促增殖作用在20ng/ml達高峰。同時，PDG

4、F-C增強了內(nèi)皮細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞的遷移能力，對間充質(zhì)干細胞遷移作用強于血管內(nèi)皮細胞;(2)掃描電鏡顯示微載體藥物具有良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒徑大小50-100nm;紅外圖譜提示存在磺化取代;微載體對PDGF-C包封率為54.42％，載藥率為20.33％;微載體體外72小時緩釋PDGF-C累計釋放率82.25％;體外凝血實驗表明藥物微載體具有顯著抗凝血作用(P＜0.05)，抗凝血效果呈劑量效應(yīng)關(guān)系，當(dāng)濃度為50mg/ml時其抗凝血效果與肝

5、素相比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P≥0.05）;溶血實驗顯示，樣品濃度為10mg/ml、30mg/ml、50mg/ml時，溶血率分別為0.81％、1.08％、1.21％，符合國標關(guān)于溶血率小于5％的安全標準;細胞毒性試驗，微載體藥物濃度為10mg/ml時，細胞毒性級別為0級，濃度為30mg/ml、50mg/ml時，細胞毒性級別為1級，表明凝血微載體藥物的浸提液無明顯的細胞毒性;(3)微載體藥物移植后，血管內(nèi)皮修復(fù)速度明顯增加，7d修復(fù)率達到9