益腎健脾灸法對(duì)去卵巢大鼠的影響及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、一、目的:
　　觀察去卵巢絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型大鼠骨代謝指標(biāo)、骨形態(tài)的變化，并進(jìn)一步觀察益腎健脾灸法的治療作用，探討其治療PMOP的作用機(jī)制，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察益腎健脾灸法血清對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖率、Itgβ1、FAK及RAS的影響，從細(xì)胞分子水平探討其治療PMOP的作用機(jī)理。
　　二、方法:
　　1.益腎健脾灸法對(duì)去勢(shì)大鼠骨代謝指標(biāo)及骨形態(tài)的影響
　　(1)模型的建立及分組干預(yù):取

2、3月齡雌性SD大鼠，采用卵巢切除術(shù)的方法，建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型。3個(gè)月后，將造模組大鼠60只，隨機(jī)分5組，即模型組、雌二醇組、益腎灸法組、健脾灸法組、益腎健脾灸法組。假手術(shù)組、模型組大鼠不給任何藥物與治療;雌二醇組大鼠以苯甲酸雌二醇后肢肌肉注射;益腎灸法組大鼠取腎俞（雙）、關(guān)元穴施灸，健脾灸法組大鼠取脾俞（雙）穴施灸，益腎健脾灸法組大鼠取腎俞（雙）、關(guān)元、脾俞（雙）穴施灸，每次每穴灸3壯，每日1次，7次為1療程，療程間休息3天，

3、再行下一療程，共艾灸3個(gè)療程，持續(xù)30天。
　　(2)標(biāo)本處理:治療結(jié)束后，大鼠禁食24小時(shí)，腹主動(dòng)脈取血，離心待查。取大鼠右側(cè)脛骨，脫鈣處理，常溫保存;取左側(cè)脛骨、腰椎，-80℃冰箱保存待查。
　　(3)指標(biāo)檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中E2、BALP、BGP、PICP、PINP骨代謝指標(biāo)含量;采用HE染色觀察骨組織形態(tài);采用雙能骨密度儀檢測(cè)BMD;采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)、壓縮試驗(yàn)檢測(cè)生物力學(xué);采用Real-time PCR

4、檢測(cè)Itgβ1、FAK及RAS mRNA的表達(dá)。
　　2.益腎健脾灸法對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞的影響
　　(1)灸法血清的制備:取3月齡雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為益腎健脾灸法組與空白對(duì)照組。益腎健脾灸法組大鼠取腎俞（雙）、關(guān)元、脾俞（雙）穴施灸，每次每穴灸3壯，每日1次，7次為1療程，療程間休息3天，再行下一療程，共艾灸3個(gè)療程，持續(xù)30天;空白對(duì)照組組大鼠除不作針灸治療外，余處理同益腎健脾灸法組。于最后一次針灸后1h腹主動(dòng)

5、脈無(wú)菌取血，凝固后離心取血清備用。
　　(2)細(xì)胞培養(yǎng):將MC3T3-E1細(xì)胞分為空白對(duì)照組(含10％FBS、DMEM)，血清對(duì)照組(含10％空白血清、DMEM)與益腎健脾灸法血清組(含10％益腎健脾灸法血清、DMEM)三組進(jìn)行培養(yǎng)。
　　(3)指標(biāo)檢測(cè):細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，用MTT法檢測(cè)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性，采用Real time PCR檢測(cè)細(xì)胞中Itgβ1、FAK及RAS mRNA的表達(dá)，蛋白免疫印跡(Weatern

6、Blot)檢測(cè)Itgβ1、FAK及RAS蛋白的表達(dá)。
　　三、結(jié)果:
　　1.模型組大鼠骨小梁稀疏、結(jié)構(gòu)松散，骨密度降低，骨最大負(fù)荷、最大應(yīng)力均下降，血清E2含量降低，BALP、BGP、PICP、PINP含量增加，骨組織Itgβ1、FAK及RAS mRNA表達(dá)顯著升高。益腎健脾灸法組大鼠骨小梁規(guī)則、密集，骨密度升高，骨最大負(fù)荷、最大應(yīng)力均有不同程度提升，血清E2含量升高，BALP、BGP、PICP、PINP含量降低，骨組織I

7、tgβ1、FAK及RAS mRNA表達(dá)降低。
　　2.益腎健脾灸法血清能促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，也可促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞Itgβ1、FAK及RAS mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　四、結(jié)論:
　　1.益腎健脾灸法能增加去卵巢大鼠的骨密度、提高骨生物力學(xué)性能、改善骨組織形態(tài)變化，達(dá)到防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的目的。
　　2.益腎健脾灸法可通過(guò)上調(diào)Itgβ1、FAK及RAS的表達(dá)，促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的增殖，