成骨不全致病基因突變及Ⅰ型膠原蛋白基因甲基化分析.pdf

1、成骨不全（Osteogenesis imperfecta，OI），是一種遺傳性結(jié)締組織疾病，其特點(diǎn)通常表現(xiàn)為多發(fā)性骨折、低骨密度，其他臨床癥狀還包括長(zhǎng)期骨折引起的骨骼畸形，脊柱側(cè)凸，藍(lán)鞏膜，牙本質(zhì)發(fā)育不全，皮膚彈性下降，關(guān)節(jié)和韌帶松弛等。成骨不全是遺傳性的罕見病，發(fā)病率很低，在兒童中發(fā)病率大約為1/12000-15000。成骨不全具有表型及遺傳異質(zhì)性，有常染色體顯性遺傳以及常染色體隱性遺傳兩種遺傳方式。根據(jù)臨床表型以及致病基因，成骨不全

2、迄今分為15個(gè)亞型。約90％的患者是由于Ⅰ型膠原蛋白結(jié)構(gòu)個(gè)基因COL1A1、COL1A2突變而引起。常染色體隱性遺傳所占患者數(shù)量少，但致病基因種類眾多，包括SERPINF1、 CRTAP、 LEPRE1、PPIB、SERPINH1、FKBP10、S P7、BMP1、TMEM38B、WNT1、CREB3L1以及成骨不全與Brcuk綜合征等致病基因P LOD2共12種。
　　研究目的：
　　對(duì)文獻(xiàn)已報(bào)道的成骨不全臨床樣本進(jìn)行常染

3、色體顯性遺傳以及常染色體隱性遺傳等共15個(gè)致病基因進(jìn)行突變檢測(cè)。
　　研究方法：
　　經(jīng)山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，采集110例成骨不全患者靜脈血和臨床信息。提取外周靜脈血基因組 DNA，利用實(shí)驗(yàn)室前期建立的檢測(cè)方法，采用 Touch-down PC R方法進(jìn)行目的基因片段的擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)首先篩選的是COL1A1與COL1A2基因，若二者未發(fā)生突變，則進(jìn)行12種常染色體隱性致病基因的篩選以及骨質(zhì)疏松相關(guān)基因 PLS3的檢測(cè)。

4、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Sanger測(cè)序后通過Mutation Survery軟件分析變異位點(diǎn)，并通過PolyPhen, Mutation Taster、Align GVGD與SIFT軟件預(yù)測(cè)變異對(duì)蛋白質(zhì)功能的影響。進(jìn)一步通過I型膠原蛋白突變數(shù)據(jù)庫(kù)、人類突變數(shù)據(jù)庫(kù)與dbSNP等篩選變異位點(diǎn)，進(jìn)而識(shí)別突變位點(diǎn)。同時(shí)初步探討突變與臨床表型之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　在110例成骨不全患者中，篩選到COL1A1/COL1A2基因突變63

5、例，IFITM5突變患者7例， SERPINF1突變2例，WNT1突變5例者。未檢測(cè)到突變患者33例。
　　COL1A1/COL1A2基因變異位點(diǎn)合計(jì)79個(gè)，多存在于三螺旋區(qū)，其中36個(gè)為新發(fā)變異，尚有待于進(jìn)一步通過健康人群篩查是否為致病突變位點(diǎn)。COL1A1/COL1A2突變主要為錯(cuò)義突變，特別是甘氨酸的替換，約占替換氨基酸的58%，且以甘氨酸被絲氨酸替代的比率為最高。突變具有外顯子偏好性，COL1A1基因的第8號(hào)外顯子，以及C

6、OL1A2基因的17、19、38號(hào)外顯子區(qū)域均為突變頻率高發(fā)區(qū)。此外，在COL1A1的致死突變區(qū)（p.869-1001）發(fā)現(xiàn)5個(gè)突變，COL1A2的致死突變區(qū)（p.409-454，p.637-670，p.712-727， p.847-901，p.949-997）發(fā)現(xiàn)6個(gè)突變位點(diǎn)。7例 V型成骨不全患者均發(fā)現(xiàn) IFITM5 c.-14C>CT雜合突變，該7例患者臨床表型均為嚴(yán)重型，骨骼創(chuàng)傷后容易形成肥大的增生性愈傷組織。
　　2例成

7、骨不全患者均為SERPINF1復(fù)合雜合突變， c.167C>CG+c.215C>CT復(fù)合雜合突變患者為嚴(yán)重的III型，c.215C>CT+c.907C>CT雜合突變患者臨床癥狀相對(duì)較輕。5例成骨不全患者為WNT1突變，其中2個(gè)為純合缺失，其余為雜合突變。患者具有眼瞼下垂表型，個(gè)別患者還有精神亢奮的表現(xiàn)。
　　結(jié)論：
　　對(duì)110例臨床成骨不全患者進(jìn)行了基因檢測(cè)，其中77例患者檢測(cè)到致病基因突變位點(diǎn)，絕大部分為COL1A1與C