短梗霉P6菌株中有菊粉酶活性的β-呋喃果糖苷酶的研究.pdf

1、β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)，是糖苷水解酶GH32家族的成員。它不但可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖，而且具有一定果糖轉(zhuǎn)移酶活性，參與以蔗糖為底物合成寡糖。廣泛存在于細菌、酵母、絲狀真菌、高等植物和許多動物細胞中。
　　短梗霉(A ureobasidium sp.)P6菌株（以下簡稱P6菌株）是從海洋環(huán)境中分離獲得的，可以產(chǎn)生多聚蘋果酸的菌株，同時該菌株具有一定分解菊粉能力。在之

2、前的研究中，并沒有短梗霉(Aureobasidium spp.)具有菊粉酶基因的相關(guān)報道，但短梗霉可產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的研究較多，本研究旨在探究P6菌株分解菊粉的能力與β-呋喃果糖苷酶活力的關(guān)系，以便獲得高產(chǎn)具有菊粉酶活力的β-呋喃果糖苷酶生產(chǎn)菌株。
　　本研究首先在實驗室短梗霉菌種庫中分離篩選到了具有較強分解菊粉能力的P6菌株，其初始菊粉酶活力為16.5±0.6 U/mL;經(jīng)過產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定P6菌株分解菊粉的最佳培養(yǎng)基組成為

3、:菊粉2.5％(w/v)，酵母粉1.0％(w/v)，接種量2.5％(v/v)，硫酸銨0.6％(w/v)，磷酸二氫鉀1.0％(w/v)，七水硫酸亞鐵0.05％(w/v)，七水硫酸鎂0.1％(w/v);在此條件下，經(jīng)28℃和180 rpm振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束時發(fā)酵液菊粉酶活力單位達到26.15±0.5 U/mL;并進行了10-L發(fā)酵罐（裝液量6.0L）擴大培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵108 h后發(fā)酵液菊粉酶活力單位最高達到30.98±0.8 U/mL

4、，發(fā)酵144 h總糖幾乎完全利用，總糖利用率達到98％以上。
　　在P6菌株的最佳產(chǎn)酶條件下，經(jīng)高壓破碎、離心濃縮、DEAE Sepharose離子交換柱、Sephadex S-100凝膠過濾層析等步驟分離與純化得到了具有菊粉酶活力的β-呋喃果糖苷酶，其表觀分子量約為47.6 kDa;所得β-呋喃果糖苷酶水解菊粉最適溫度60℃，55℃以下熱穩(wěn)定性良好，最適pH為4.5，在pH3.0-8.0之間，酶的pH穩(wěn)定性較好，Hg2+、Cu2

5、+、Mn2+和SDS對酶抑制作用較為顯著，其水解蔗糖時Km為29.16 mM/L、最大反應(yīng)速度Vmax為0.34μM/min。所得β-呋喃果糖苷酶具有水解蔗糖以及轉(zhuǎn)移酶活力，其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)與水解菊粉表現(xiàn)一致。
　　成功克隆得到P6菌株部分β-呋喃果糖苷酶基因，命名為BFT1（登錄號:KP857569），從該基因推導(dǎo)的氨基酸經(jīng)過氨基酸序列比對，確定其屬于β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）(EC3.2.1.2

6、6)，是糖苷水解酶GH32家族的成員;為進一步驗證P6菌株水解菊粉與其β-呋喃果糖苷酶的關(guān)系，構(gòu)建β-呋喃果糖苷酶基因敲除載體，該敲除載體轉(zhuǎn)化到P6菌株細胞后，獲得的敲除菌株Q1;通過熒光定量PCR比較Q1敲除菌株和P6菌株BFT1基因的相對表達量，Q1菌株BFT1基因的表達量為P6菌株中BFT1基因表達量的5.69％。敲除菌株Q1與P6菌株相比，菊粉酶、蔗糖酶及轉(zhuǎn)移酶活力均有不同程度的下降，證實原始菌株P(guān)6表現(xiàn)出的菊粉酶活力與其自身的